Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Otoimmün hipofizit, hipofiz bezinin büyümesi ve bir veya daha fazla hipofiz hormonunda eksiklik ile karakterizedir. Etken otoantijenler bilinmemektedir. Burada, bu hastalığın incelenmesinde kullanılmak üzere fare hipofiz bezi proteinlerinin hazırlanması için bir protokol gösterilmiştir.

İlk olarak, hipofiz bezleri ötenazi uygulanmış farelerden izole edilir. Hipofizler daha sonra hücreleri mekanik olarak parçalamak ve sitozolik proteinleri serbest bırakmak için homojenize edilir. Homojen, düşük hızlı santrifüjleme ile arıtılır ve poli akrilamid jel elektroforezi ile kolorimetrik, BCA testi ve kalite ile miktar açısından değerlendirilir.

Son olarak, sulu protein homojenatı yağlı bir adjuvan ile karıştırılır. Bu karışım daha sonra otoimmün hipofizite benzeyen bir fare modeli oluşturmak için farelere enjekte edilir. Eşlik eden videoda gösterildiği gibi, deney hayvanlarında hipofiziti indüklemek için dört teknik tanımlanmıştır.

Bu makalede sunulan teknik, yani hipofiz proteinlerinin enjeksiyonu, karışım, influenza adjuvanı, 1960'lara dayanan en eski tekniktir. Diğer yaklaşımlar, 1992'de kızamıkçık virüsünden çözünür glikoproteinlerin enjeksiyonu, 2002'de bir adenovirüsün doğrudan hipofiz bezine stereotaktik enjeksiyonu ve 2010'da başka bir sıçan suşunun böbrek kapsülü altında bir sıçan suşundan transplantasyon hipofiz bezi olmuştur. Floransa'nın adjuvan yaklaşımının temel avantajı, günümüzde daha az invaziv, daha tutarlı ve hepsinden önemlisi, insan muadillerine çok benzeyen bir hastalığı indüklemede daha doğru olmasıdır.

1960'lardan beri bildirilmesine rağmen, yabancı adjuvan tekniği hipofizit indüksiyonu için kötü performans göstermiştir. Doktora çalışmama başladığımda, yayınlanmış yabancı adjuvan protokolünü kullanarak sadece mütevazı bir hipofizit örneği ve şiddeti elde edebildim. EM duygusunda bulunan pitu proteinlerinin miktarını on kat artırma fikrim olduğunda işler önemli ölçüde iyileşir.

Bu yöntemler otoimmün hipofizitin patogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, oto-antijenlerin tanımlanmayı beklediği diğer otoimmün hastalıkları incelemek için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemlere yeni olan bireyler, el becerileri, zaman ve özveri gerektirdiğinden, esas olarak son adım olan marjın hazırlanması ile mücadele edeceklerdir. Bu nedenle görsel gösterim, uygun bir emülsiyonun nasıl hazırlanması gerektiğini anlamak için kritik öneme sahiptir.

Bu tekniğin anlamı, oto bağışıklık alanının ötesine uzanır. Antijenin bağışıklama için nasıl hazırlanacağını bilmek, monoklonal antikorların üretiminde veya yeni aşıların test edilmesinde de kullanılabilir. Bu tekniği gösteren, laboratuvarımdan S Hayvanat Bahçesi kahramanı Ura ve Mayland al gato olacak.

Fare hipofiz, terika adı verilen sfenoid kemiğin bir çöküntüsünde kafatasının tabanında oturan silindirik şekilli bir bezdir. Bez lateral olarak trigeminal sinirler ve anterior olarak optik sinir kiazması ile sınırlanmıştır. Daha büyük bir ön lob ve daha küçük, orta ve arka loblardan oluşur.

Hipofiz bezini izole etmek için, ötenazi farenin başını kesmek için makas kullanın, ardından kafatasının arkasından önüne paralel kesimler yapın. Beyni kaldırın ve ikizkenar üçgen bağlamında bir silindir gibi görünen hipofiz bezini ortaya çıkarmak için geriye doğru çevirin. Hipofiz bezinin bir taban olarak, trigeminal sinirlerin yanlar olarak ve optik kiazmanın bir tepe noktası olarak olması.

Çevreleyen meninga'yı kırmak için bezi kapalı forseps uçlarıyla daire içine alın. Daha sonra ince forseps kullanarak Turca'nın hücresinden hipofizi alın ve kuru buz üzerinde plastik bir tüpe koyun. Bir hazırlık için 300 fare hipofiz bezi toplayın.

Bu koleksiyon yaklaşık dokuz kişi saat gerektirir. Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hipofiz bezlerini ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Buz banyosuna 15 mililitrelik bir Falcon tüpü yerleştirin.

Tüpe 250 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin. Homojenizasyondan hemen önce toplanan her 100 hipofiz için, fare hipofiz bezlerini tampona ekleyin. Ardından, fare hipofizlerini içeren Falcon tüpünün dibine beş milimetre çapında bir jeneratör olan poli tron homojenizatörün ucunu yerleştirin ve 30 saniye boyunca maksimum hızda homojenize edin.

Tüpü buz üzerinde tutarken nazikçe yukarı ve aşağı hareket ettirin. Daha sonra homojenatı bir dakika buz üzerinde dinlendirin. Homojenizasyon ve soğutma adımlarını iki kez daha tekrarlayın.

Bu nazik homojenizasyon, hücreleri parçalamalı ve çekirdek santrifüjünü kırmadan proteinleri serbest bırakmalıdır. Düşük hızda, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yaklaşık 1000 G'yi tortuya, çekirdeğe, kırılmamış dokuya ve bağ dokusu ve denatüre protein kompleksleri gibi çözünmeyen maddelere homojenleştirir. Peleti rahatsız etmemeye özen gösterin.

Şimdi post nuclear sate veya PNS olarak adlandırılan SNA'yı yeni bir Falcon tüp mağazasına aktarın. Buz üzerindeki PNS, daha önce olduğu gibi homojenize etmeden ve santrifüjlemeden önce olduğu gibi aynı hacimde homojenizasyon tamponu kullanarak peleti geri çeker. İki PNS örneğini bir araya getirdikten sonra, çözeltiyi çok sayıda mikro santrifüj tüpüne boşaltın.

Mikro santrifüj tüplerini ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu protein preparatı eksi 80 santigrat derecede stabildir, ancak yavaş yavaş gücünü kaybeder. Bu nedenle, hazırlandıktan sonraki altı ay içinde kullanılması tavsiye edilir.

Biy asit tahlili ile protein verimini ve konsantrasyonunu belirlemek için küçük bir PNS alikotunu saklayın. Daha sonra, ortalama toplam ağırlığı yaklaşık 570 miligram olan 300 fare hipofiz bezinden jel elektroforezi ile protein kalitesini belirleyin. Her 10 miligram doku için 60 miligram hipofiz proteini veya bir miligram protein verimi bekleyin.

Protein konsantrasyonu tipik olarak mililitre başına 40 miligram civarındadır. Burada verilen örnek, 10 fareyi aşılamak içindir. Her fareye bir miligram hipofiz proteini içeren 100 mikrolitre emülsiyon enjekte etmeyi planlayın, burada hazırlık sırasında malzeme kayıpları için iki ekstra fareye izin verin, 12 miligram protein emülsiyonu hazırlanır.

Dondurulmuş protein alikotlarını ellerinizde ısıtarak hızla çözdürerek başlayın. PBS ile protein konsantrasyonunu mililitre başına 20 miligrama ayarlayın. Daha sonra, 12 miligrama karşılık gelen 600 mikrolitre hipofiz proteini ekstraktını, 2.5 mililitrelik bir Gaz Tite Hamilton şırınga süspansiyonuna, tam FRONS adjuvanına veya mililitre ısı başına beş miligram içeren CFA'ya elle çalkalayarak mikobakteri tüberkülozu ile çekin.

Daha sonra 600 mikrolitre CFA'yı başka bir 2,5 mililitrelik Hamilton şırıngasına çekin. CFA ile doldurulmuş şırıngaya 22 gauge mikro emülsifiye edici bir iğne takın ve sabitleyin. Pistonu, iğne CFA ile dolacak şekilde yavaşça itin.

Daha sonra iğnenin diğer ucunu hipofiz proteini özü ile doldurulmuş diğer şırıngaya takın ve sabitleyin. Şırıngaların içinde hava kabarcıkları sıkışmasını önleyin. Yağ bileşenini sulu hipofiz ekstraktına itmek için CFA şırıngasının pistonunu yavaşça ilerletin, böylece sadece küçük bir miktar karıştırılır.

Ardından hipofiz özü şırıngasının pistonunu CFA şırıngasına geri itin. Tüm içerik karışana kadar karıştırılan malzeme miktarını kademeli olarak artırmak için bu işlemi tekrarlayın. Bu beyazımsı ve eşit dağılmış malzeme, su ve yağ emülsiyonunu temsil eder.

Emülsiyon oluşturulduktan sonra, son döngüden sonra tam ileri geri döngüyü en az 500 kez tekrarlayın, şırıngalar, hipofiz protein konsantrasyonunun şimdi mililitre başına 10 miligram olduğu bire bir su ve yağ emülsiyonu içerecektir. Emülsiyon, emülsiyonun kalitesini bir damla suya damlatarak test etmek için kullanıma hazırdır. Emülsiyon doğru bir şekilde hazırlanırsa, damla yüzeyde kompakt ve sıkı kalacaktır.

Emülsiyon kalitesiz ise, yayılır ve daha küçük damlalara bölünür. Emülsiyon, deneysel otoimmün hipofiziti indüklemek için hazırlandığı gün SJL farelerine enjekte edilir. Bu protokol, beraberindeki dikey jo'da detaylandırılmıştır.

Pitu bezi toplandıktan ve teknikler öğrenildikten sonra, hızlı ve buz üzerinde çalışmayı hatırlayarak protein talimatını bir saat içinde gerçekleştirebilirsiniz. Bu adım sırasında, yaklaşık bir saat gerektiren daldırma hazırlığı sırasında. Geliştirildikten sonra ilk karıştırma aşamasında yavaş ve sabırla çalışmayı unutmayın.

Bu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların, otoreaktif lenfositlerin hedef organı tanıma ve sızma mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fare hipofiz bezinden bir protein ekstraktının nasıl hazırlanacağı ve bir immünojen olarak kullanılmaya hazır bir emülsiyon hazırlamak için Crohn'un aju olanlarıyla nasıl karıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnaktive edilmiş ve kuru mikrobakteriyel tüberküloz içeren şırıngalar ve tam grip kenarı şırıngalarla çalışmanın, yanlışlıkla kendinizi delinmeniz durumunda tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman G kızdırıcıları kullanın ve iğneleri uygun şekilde atın.