Name: Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Öğrenin fare hipofiz proteinlerinin izolasyonu ve homojenizasyonu ile otoimmün hipofizitis araştırmaları için immünojen hazırlama yöntemini. Bu protokol, nöroimmünoloji ve endokrinoloji alanlarında güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma PC NIH hibe DK080351 tarafından desteklenmiştir.

Deneysel Protokolü Bu deney protokolünde ilk adım fare hipofiz bezi çok sayıda toplamak için. İkinci adım, bir protein elde etmek için bezleri homojenize. Üçüncü adım, yağlı bir karışım olan bu proteinler emülsifiye. Adım 1: fare hipofiz bezi toplanması ve depolanması Fare hipofiz bezi, optik kiazma trigeminal sinirler ve anteriora yanal çevrili sfenoid kemiğin sella tursika denilen bir depresyon, kafatasının dibinde oturur. Bezinin daha büyük bir ön lob ve küçük bir arka ve orta loblar oluşur ve ortalama 1.9 mg ağırlığında. Hipofiz bezlerin hayvan bakım tesisi tarafından ötenazi olmak kaderinde karışık suşlar, cinsiyet ve yaştan, farelerden alınan toplanır. Hipofiz bezi izole etmek için, fare, disseke kafatası üzerinde cilt ötenazi ve kafatası kemiği makasla kesilerek açılır. Beyin, hipofiz bezi, daha sonra çevredeki duramater izole maruz kaldırdı sfenoid kemik scooped ve kuru buz üzerinde plastik bir tüp içinde depolanır. Genel olarak bir protein hazırlık, 9 saat bir kişi tarafından toplanan çok sayıda fare 300 hipofiz bezleri kullanırlar. Sonra, koleksiyon tamamlandığında, hipofiz bezleri içeren tüp sonraki adım için -80 ° C hazır olana kadar saklanır. 2. Adım. Fare hipofiz proteinleri çıkarımı <ol><li> 15 ml Falcon tüp (katalog 352.059) homojenizasyon tampon tampon 250 mcL toplanan her 100 hipofiz bezi kullanarak bir buz banyosunda tutulur. Hücre (0.2 M) ve fizyolojik pH (7.4) sitoplazma içinde fizyolojik olarak mevcut olan bir benzer iyonik güçlü bir tampon kullanın. Biz fosfat bir proteaz inhibitörü kokteyl (Sigma-Aldrich, katalog hiçbir P8340-1 ml) ile desteklenebilir (0,161 M, pH 7.4), tamponlu tuz kullanın. </li><li> Homojenizasyon önce tampon hipofiz bezi ekleyin ve sonra Falcon tüpün dibinde Polytron homojenizatörlerinin jeneratör (5 mm çap) yerleştirin. Buz banyosu içinde tutarak hafifçe yukarı ve aşağı hareket Falcon tüp, 30 saniye boyunca maksimum rpm&#39;de homojenize edilir. Daha sonra, 1 dakika boyunca buz üzerinde Homojenat bekletin. Homojenizasyon tekrarlayın ve soğutma iki kez daha adım. Bu nazik homojenizasyon, hücrelere zarar ve çekirdekleri aksatmadan sitozolik proteinler serbest bırakmak gerekir. </li><li> Çekirdekleri, kesintisiz doku ve çözünmez malzemeleri (bağ dokusu ve denatüre protein kompleksleri gibi) çıkarmak için, 10 dakika 4 ° C düşük hızda (1000g) Homojenat santrifüj </li><li> (PNS, Post-Nükleer Süzüntü olarak adlandırılır), yeni bir Falcon tüp süpernatantı transfer pelet rahatsız terk etmeye özen ve buz üzerinde PNS saklamak. </li><li> Homojenizasyon tampon hacmi (toplanan her 100 hipofiz bezi için tampon 250 mcL) pelletini tekrar, yukarıdaki gibi homojenize yukarıdaki gibi santrifüj ve ilkinden sonra ikinci PNS birleştirmek. </li><li> -80 Mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza kısım iki toplanmış PNS örnekleri ° C sonraki adım için hazır olana kadar. Bu protein, hazırlama, -80 saklanabilir ° C, ancak yavaş yavaş onun kudret kaybeder, bu nedenle hazırlık itibaren 6 ay içinde kullanmanızı öneririz. Jel elektroforezi ile protein verimi ve konsantrasyon BCA yöntemi ile (Pierce katalog no. 23225) ve protein kalitesini belirlemek için küçük bir kısım kullanın. Genel olarak, yaklaşık 40 mg / ml konsantrasyonda, 1.5 mL homojenizasyon tampon 300 fare pitüiter yaklaşık 60 mg protein almak. </li></ol> Adım 3. Bağışıklama için emülsiyon hazırlanması <ol><li> Deney için gerekli donmuş protein alikotları hızla çözülme ve protein konsantrasyonu 20 mg / ml &#39;ye ayarlayabilirsiniz. Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141) öldürdü ısı 5 mg / ml içeren Komple Freund adjuvan (CFA, Sigma F-5881) Bu protein ekstresi 1:1 emülsiye olur. Her fare emülsiyon 100 mcL hipofiz ekstresi 1 mg alacaksınız. </li><li> Burada verilen örnek, her bir fare 100 mcL 1 mg hipofiz proteinleri içeren emülsiyon ile enjekte edilecektir 10 fare, immunizing için. Hazırlanması sırasında maddi kaybı için iki ekstra farelerin izin ver, bu yüzden 12 mg hipofiz proteinlerin kullanın. 20 mg / ml hipofiz protein ekstresi Aspire 600 mcL 2.5 mL Hamilton gaz geçirmez şırınga kullanılarak yukarıdaki açıklar. Sallayarak CFA süspanse edin ve başka bir 2.5 mL Hamilton şırıngaya CFA 600 mcL talip. CFA dolu şırınga, 22 gauge bir mikro-emülgatör iğne takın ve güvenli. CFA iğne ile dolu olduğunu CFA şırınganın pistonu yavaşça itin, sonra diğer ucunu takın ve güvenlihipofiz ekstresi ile dolu şırınga, iğne. </li><li> Yavaş yavaş yağ bileşeni sadece küçük bir miktar karışık olduğu gibi hem aköz hipofiz ekstresi, içine itmek için CFA şırınga pistonu ileri. Sonra CFA şırıngaya hipofiz ekstresi şırınganın pistonu geri itin. Karıştırılan malzeme miktarı yavaş yavaş artan bu işlemi tekrarlayın. Iki şırınga tüm içerik karışıncaya kadar devam edin. Su-yağ emülsiyonu temsil eden bir beyazımsı ve eşit bir çözüm elde edilecektir. </li><li> Emülsiyon yapıldıktan sonra, emülsiyon iyice karıştırılır sağlamak için en az 500 defa geri ve ileri-hareketi tekrarlayın. 01:01 su-yağ emülsiyonu son karıştırma sonra, kullanıma hazır ve 10 mg / ml hipofiz protein konsantrasyonu içerir. Emülsiyon arkadaşı vallahi makalede ayrıntılı olarak, aynı gün anestezi SJL farelere subkutan enjekte olacaktır. </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

1962 4 otoimmün hipofizitis ile ilk hasta rapor olmasına rağmen, patojen hipofiz otoantijenler 5 tanımlanabilir kalır. Hayvan modelleri, hasta bakımı çevrilebilir biyobelirteç keşif yardım, bu otoantijenler tanımlamak için çok yararlı olabilir. Bu makale, deneysel hayvanlarda otoimmün hipofizitis inducing için yeterli bir form hipofiz proteinler hazırlamak için basit bir işlemdir göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>15-ml Falcon tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homojenizasyon tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteaz inhibitör kokteyli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homojenizatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA analizi</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Komplet Freund&amp;rsquo;s Adjuvanı (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL Hamilton sızdırmaz şırınga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22-gauge mikro-emülsiyon iğnesi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deneysel otoimmün hipofizitis İndüksiyon fare hipofiz İmmunogen hazırlanması

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Otoimmün hipofizitis otoimmünite 1 neden olduğu ya da eşlik hipofiz bezinin kronik iltihabıdır. Geleneksel olarak, nadir görülen bir hastalık kabul edilmiştir, ancak raporlama son yıllarda önemli ölçüde arttı. Hipofizitis, aslında, T lenfositleri, CTLA-4 2 ve PD-1 reseptör olarak ifade inhibitör reseptörlerini bloke eden antikorlar ile tedavi edilen kanser hastalarında bir &quot;yan etkisi&quot; olarak seyrek değil geliştirir. Otoimmün hipofizitis bir adjuvan 3 ile karışık hipofiz proteinleri ile farelere enjekte edilerek deneysel olabilir. Bu video makalede fare hipofiz bezi ve nasıl SJL farelerde otoimmün hipofizitis inducing için uygun bir form hazırlamak için protein ayıklamak için nasıl göstermektedir.

Otoimmün hipofizitis fare hipofiz proteinlerin bir özü enjekte farelerde çoğaltılabilir.

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Otoimmün hipofizit, otoimmünite tarafından tetiklenen veya ona eşlik eden, hipofiz bezinin kronik bir inflamasyonudur1. Geleneksel olarak bir ... olarak değerlendirilmiştir.

Otoimmün hipofizit, hipofiz bezinin büyümesi ve bir veya daha fazla hipofiz hormonunda eksiklik ile karakterizedir. Neden olan otoantijenler bilinmemektedir. Burada, bu hastalığın incelenmesinde kullanılmak üzere fare hipofiz bezi proteinlerinin hazırlanmasına yönelik bir protokol gösterilmektedir.Öncelikle, ötanize edilen farelerden hipofiz bezleri izole edilir. Ardından, hücreleri mekanik olarak parçalamak vele sitozolik proteinleri serbest bırakmak için hipofiz bezleri homojenize edilir. Homojenat, düşük hızlı santrifüjleme ile saflaştırılır; miktarı kolorimetrik BCA testiyle, kalitesi ise poliakrilamid jel elektroforezi ile değerlendirilir.Son olarak, sulu protein homojenatı yağlı bir adjuvan ile karıştırılır. Bu karışım, ardından otoimmün hipofizitis'i andıran bir fare modeli oluşturmak için farelere enjekte edilir. Eşlik eden videoda gösterildiği üzere, deneysel hayvanlarda hipofizitis indüklemek için dört teknik tanımlanmıştır.Bu makalede sunulan, hipofiz proteinleri karışımı influenza adjuvanının enjekte edilmesi tekniği, 1960'lara kadar uzanan en eski yöntemdir. Diğer yaklaşımlar arasında 1992'de rubella virüsünden çözünür glikoproteinlerin enjekte edilmesi, 2002'de bir ad

preparation-mouse-pituitary-immunogen-for-induction-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video otoimmün hipofizitis SJL fareler ve histopatoloji ile şiddetini değerlendirmek için nasıl ikna etmek için nasıl gösterir.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Bu video, bir murin modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonu oluşturmak için etkili bir homojenizasyon tekniğini göstermektedir. Emülsiyon, inaktive edilmiş bir patojenik bakteri içeren sürekli bir yağ fazı ile çevrili su fazında bir otoantijen - miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) içerir. Emülsiyon, uzun süreli bir bağışıklık tepkisi için sürekli bir antijen salınımı sağlar.

Otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonunun hazırlanması

Video, miyelin oligodendrosit glikoproteinleri ve inaktive edilmiş Mycobacterium tuberculosis'in bir kombinasyonunu enjekte ederek bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelit indüksiyonunu göstermektedir. Model, araştırmacıların hastalık mekanizmalarını incelemelerine ve terapötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Nöral kök / progenitör hücreler (NPC) nakli rejeneratif nöroloji büyük vaatlerde tutar. NPC sistemik teslimi, beyin ve merkezi sinir sistemi hasarı deney kronik enflamatuar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilikteki kök hücrelerini sunmak için etkili invazif düşük, ve terapötik açıdan etkili, çok protokol dönüşmüştür.

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Bu yazıda, araştırmacının göz içi üveitinin fare modelini oluşturmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz. Daha yaygın olarak deneysel otoimmün üveit (EAU) olarak adlandırılan bu yerleşik model, insan hastalığının birçok yönünü yakalar. Burada, birkaç okuma kullanarak hastalığın ilerlemesinin nasıl indükleneceğini ve izleneceğini açıklayacağız.

Deneysel Otoimmün Üveit: Göz İçi İnflamatuar Bir Fare Modeli

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

NOD faresinde spontan otoimmün tiroidit olduğu gibi, Hashimoto tiroiditinin çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. H-2h4 fareler, HT indüksiyonu için basit ve güvenilir bir modeldir. Bu makalede SAT murin modelinin daha iyi anlaşılması için bu yaklaşım anlatılmakta ve patolojik süreç değerlendirilmektedir.

Bir Fare Spontan Otoimmün Tiroidit Modelinin Oluşturulması

Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Öğrenin fare hipofiz proteinlerinin izolasyonu ve homojenizasyonu ile otoimmün hipofizitis araştırmaları için immünojen hazırlama yöntemini. Bu protokol, nöroimmünoloji ve endokrinoloji alanlarında güvenilir bir model sunar.

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Daha fazla video keşfet