Protozoa Termit Gut Karşı Ligandla litik Peptitler Protozoacidal Aktivitesi Test In vitro (Protozoa Kültür) ve In vivo (Mikroenjeksiyon içine Termit Hindgut)

Bu prosedürün genel amacı, sentezlenmiş ligandların formosan yer altı termitlerinin bağırsaklarındaki selüloz sindiren protozoalara spesifik olarak bağlandığını ve litik peptid ile eşleştirilmiş ligandın, bu protozoaları in vitro olarak anaerobik protozoa kültüründe ve in vivo olarak termit arka bağırsağına enjeksiyon yoluyla öldürdüğünü göstermektir. Bu işlem, öncelikle işçi termit bağırsak protozoalarının anaerobik koşullar altında ekstre edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, floresan eşleşmeli bir ligandın termit bağırsak protozoalarına in vitro bağlanmasını doğrulamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, liganda bağlı litik peptidin termite bağırsak protozoalarını in vitro ortamda öldürdüğünü göstermektir. Prosedürün son adımı ise bağlanmayı ve bağırsak protozoalarının yıkımını in vivo olarak doğrulamak için floresan bağlı ligand ile liganda bağlı litik peptidin termite arka bağırsağına enjekte edilmesidir. Termite arka bağırsağına protozoa kültürü enjeksiyonları ve floresan mikroskobu kullanarak, litik peptide bağlı bir ligandın in vitro ve in vivo ortamlarda termite bağırsak protozoalarına bağlandığını ve onları etkili bir şekilde öldürdüğünü gösteriyoruz.

Ligandın litik peptide bağlanması, protozoalara karşı toksisiteyi tek başına litik peptide kıyasla artırmıştır. Ligandın muhtemelen bakteriyel hücre membranına bağlanmaması nedeniyle E. coli gibi hedef dışı organizmalara yönelik toksisiteyi azaltırken, protozoaların kaybı iki haftadan kısa bir sürede termitlerin ölümüne yol açmaktadır. Yeraltı termitlerinin bağırsaklarındaki simbiyotik protozoaları öldürmek için LIG kolitik peptidlerin kullanılmasına yönelik sunulan bu teknik, termit kontrolü için alternatif teknikler geliştirme çabalarının bir parçasıdır.

Bağırsaklarındaki simbiyontlar olmadan kimyasallara daha az bağımlı hale gelen termitler ölür. Ligandın protozoalara bağlandığını ve ligand litik peptidinin protozoaları öldürdüğünü göstermek için termit bağırsağından protozoaları ekstrakte ederiz. Protozoaların içindeki odun parçacıkları otofloresans gösterir. Bu nedenle, floresan ligand ile işlem görmüş protozoaların sonuçlarını, işlem görmemiş protozoalarla karşılaştırmak önemlidir.

Herhangi bir yanlış pozitif sonucu önlemek amacıyla, peptitleri doğrudan arka bağırsağa enjekte ediyoruz; çünkü peptitler termitlere yedirilirse, orta bağırsaktaki proteazlar ve ön bağırsak bunları sindirecektir. New England Bio Labs'ten alınan fage display kütüphanelerini kullanarak, protozoalara bağlanan 19 adet hep peptit dizisi belirledik. Bunlar arasından, Trypanosoma brucei membranından bilinen varsayımsal glikoproteinlerle benzerlik gösteren peptit dizisine sahip ligandlardan birini seçtik.

Peptit sentezinden sonra, peptit konjugatlarının litik özelliklerini değerlendirmek amacıyla, sentezlenen peptidi E-D-A-N-S novatech reçinesi kullanılarak katı faz peptit sentezi ile C terminal floresan probuna bağladık. Bu prosedürde, sentezlenen ligand ile deneyden bir gün önce LSU protein tesisinde önceden sentezlenmiş olan litik peptidin bir konjugatını kullandık. Kullanılan tüm malzemeleri kaplamak ve protozoaların veya peptitlerin yüzeylere absorbsiyonunu önlemek için sigma coat kullandık.

Eşit bir katman uygulayın ve ertesi gün kullanmadan önce gece boyunca kurumaya bırakın. Nem ve oksijen seviyelerini bir saatten fazla süreyle düşürmek için, havayı oda sıcaklığında bir kurutucu ve tip D katalizör yığın paketleri üzerinden sürekli dolaştıracak şekilde bir eldiven kutusu (glove box) içerisinde fan kutusu hazırlayın. Eldiven kutusunu 20 ila 30 dakika boyunca sürekli bir nitrojen akışı ile doldurun ve gerektiğinde anaerobik koşulları korumak için ek nitrojen kullanın.

Ardından, Traeger U medyası hazırlayın ve pH değerini yediye ayarlayın; steril medyeyi, glove box içerisindeki oksijen kalıntılarını gidermek için %2,5 hidrojen, %5 karbondioksit ve %92,5 azot karışımı içeren bir tüpe bağlı 200 µL uç aracılığıyla bir saat boyunca filtreleyin. Materyaller hazır olduğunda, bir Petri kabından bir termit işçisi almak için pens kullanın ve termiti pensle yaklaşık 10 saniye boyunca nazikçe tutarak tüm vücudunu %70 etanolle dolu bir behere daldırın. Yüzey kontaminasyonlarını gidermek için işçiyi etanolden çıkarın ve temiz bir Kim wipe üzerinde yaklaşık 20 saniye boyunca kurumaya bırakın.

Glove box içerisinde, termit bağırsağını toplamak için 100 µL Trager U medyumu içeren silolanmış bir mikroskop lamı ve protozoaları toplamak için 900 µL Trager U medyumu içeren bir tüp hazırlayın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu ve bir çift steril ince uçlu pens kullanarak işçi termitin abdomenini tutun ve başka bir pensle abdomenin ucunu kavrayarak bağırsağı nazikçe 45 derecelik bir açıyla yukarı veya aşağı doğru çekin; dört adet orta bağırsak ve arka bağırsak bölümünü tek parça halinde toplamaya çalışın. Toplanan orta bağırsakları, bir mikroskop lamı üzerindeki 100 µL Traeger U medyumu damlasının içine yerleştirin.

Ardından lam üzerine geçiniz, protozoaları serbest bırakmak için arka bağırsakları bir çift steril ince diseksiyon probu ile deliniz ve bağırsak içeriğini 200 µL'lik bir pipet yardımıyla 900 µL Traeger medyum içeren bir mL'lik mikro santrifüj tüpüne nazikçe aktarınız. Bağırsak duvarı parçalarının çökelmesi için beş saniye bekleyiniz ve süpernatantın 900 µL'sini yeni bir tüpe aktarınız. Protozoa kültürünün on µL'sini sigma kaplı bir mikroskoba aktarınız.

Lam hazırların ve protozoaların durumunu mikroskop altında 200 kat büyütmede kontrol edin. Protozoaları elde ettikten hemen sonra, tedarikçi tarafından önerilen kültür medyumunda aerobik protozoalar, tetra piriformis, amoeba, ug, gleaner ve paramecium kontrol kültürlerinin yanı sıra bir gece bekletilmiş e coli kültürü hazırlayın; sabitlenmiş termit bağırsak protozoalarını, diğer protozoa kontrollerini ve e coli'yi 10% formaldehitle 4 °C'de 12 saat boyunca sabitleyin. Ardından, protozoa çözeltisini 30 ×g kuvvetle 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve fikse edilmiş protozoaları içeren peleti bir mililitre Trager U medya ile iki kez yıkayın, peleti bir mililitre Traeger Edia içinde süspanse edin ve fikse edilmiş mikroorganizmaları, suyla çözülmüş 50 mikromolar final konsantrasyondaki sentezlenmiş ligand çözeltisinin 100 mikrolitresi (florosan boya E-D-A-N-S'ye bağlı) ile bir ila iki saat inkübe edin. Ligandlarla işlem görmüş mikroorganizmaları ve işlem görmemiş kontrolleri, 341 nanometre maksimum absorbsiyon ve 471 nanometre mavi bölge emisyonunda, 400 kat büyütme ile bir florosan mikroskop altında gözlemleyin.

Ligand konjugeli litik peptidin tik özelliklerini değerlendirmek için, üçüncü bölümde gösterildiği şekilde hazırlanan protozoa kültüründen 198 microliter'lik altı aliquot'u 0,5 milliliter'lik einor tüplerine pipetleyin. Termit bağırsağı protozoa kültürü aliquotlarının yarısına, 100 micromolar konsantrasyonda bir ligand litik peptit çözeltisinden iki microliter ekleyin. Bir micromolar nihai konsantrasyon için, diğer yarıdaki aliquotlara kontrol olarak iki microliter steril su ekleyin.

Bir saat sonra, her bir protozoa kültüründen 10 µL'lik bir miktarı bir lam üzerine aktarın. Ligand konjuge litik peptit ile tedavi edilmiş protozoaların sağkalımını, kontrol grubuyla karşılaştırmak için 200 kat büyütmeli bir mikroskop altında inceleyin; çift aşamalı ısı seviyesine sahip bir NGI PC 10 mikropipet çekici kullanarak iğneleri çekin. 20 ila 30 µm boyutunda bir uç elde etmek için, uç boyutunu mikroskop altında ölçerek doğrulayın.

Bir mikrometre kullanarak, bir iğneyi su içinde süspande edilmiş yaklaşık 30 µL 50 µM floresan işaretli ligand ile doldurun. Kontrol için, ek bir şırınga kullanarak başka bir iğneyi su ile doldurun. Bir mikro pipeti bir tutucuya ve bir mikro manipülatöre sabitleyin. Bir iğneyi, ikinci bir mikro manipülatördeki enjeksiyon sistemi tutucusuna takın.

Başlangıç enjeksiyon parametrelerini yaklaşık bir saniyelik darbe uzunluğu ve 10 ila 12 PSI enjeksiyona ayarlayın. Ardından iğneyi yavaşça mikro pipete ilerletin ve enjeksiyon sonrası ayak pedalı kullanarak çözeltiyi enjekte edin. Mikro pipeti çıkarın ve enjekte edilen çözeltinin uzunluğunu kaydedin.

Bir kumpas kullanarak, mikro pipetin bilinen parametrelerinden enjekte edilen hacmi hesaplayın ve 0,3 µL çözelti püskürtmek için basıncı ve darbe uzunluğunu ayarlayın. Ardından, her işlem için enjeksiyon yapılacak 20 termiti hazırlayın. Öncelikle, rektumda bulunan herhangi bir boşaltım ürününü uzaklaştırmak için abdomenin ucunu yumuşak penslerle sıkıştırın.

Ardından, termit işçilerini beş dakika boyunca buz üzerinde soğutarak immobilize edin. 100 µL pipet uçlarını keserek termit işçilerini tutmak için alıcılar hazırlayın. Bir bistüri ucuyla, ucu 10 ila 12 mm uzunluğunda kesin, termitlerin boyutuna göre kullanın ve bunları bir viyale yerleştirin.

Vidalı kapağı kullanarak alıcıyı mikro manipülatöre takın. Bir işçi termiti bir Petri kabı üzerine sırt üstü gelecek şekilde yerleştirin ve azot vakum pompası kullanarak işçiyi baş kısmından alıcıya çekin; böylece işçinin arka ucu alıcıdan dışarıda kalsın. Termiti alıcıda tutarken, dolu iğneyi mikro manipülatör yardımıyla dikkatlice ilerleterek işçinin anüsüne yerleştirin. 0.3 µL floresan işaretli ligand veya su kontrolü enjekte edin.

Ligand veya su enjekte edilmiş işçileri, nemli filtre kağıdı içeren ayrı Petri kaplarına yerleştirin ve gece boyunca 26 degrees Celsius sıcaklıkta ve %78 bağıl nemde tutun. 24 saat sonra, enjekte edilen termitlerin bağırsaklarını çıkarın ve protozoaları daha önce gösterildiği şekilde toplayın. Canlı termitlerde ligand konjugasyonlu litik peptidlerin litik özelliklerini değerlendirmek için, enjekte edilen termitlerden alınan protozoalardaki ligand bağlanmasını floresan mikroskobu kullanarak gözlemleyin.

Enjeksiyon materyallerini, ekipmanları ve termitleri daha önce enjeksiyonlar için yapıldığı şekilde hazırlayın ve 20 termit işçisinin arka bağırsağına 0,3 µL 500 µM ligand litik peptid çözeltisi veya kontrol olarak su enjekte edin. 24 saat sonra, birkaç işçinin bağırsaklarını çıkarın ve tüm protozoaların tedavi edilen termit bağırsağında öldüğü onaylanır onaylanmaz bağırsak içeriğini mikroskop altında 200 kat büyütmede gözlemleyin. Kalan tedavi edilmiş termitleri ve kontrolleri nemli filtre kağıdı içeren Petri kaplarında tutun ve mortaliteyi günlük olarak gözlemleyin. Floresan proba bağlı ligandın p grassi, h heart mani ve sla olmak üzere üç protozoa türünün tamamına bağlandığını onaylıyoruz.

Dört adet mosson yeraltı termitinin arka bağırsağından elde edilen, saptanabilir yoğunluklardaki örneklerde, ligand bağlanmasının tüm hücre yüzeyinde gerçekleştiği ve protozoaların aksı üzerindeki, mikrotübül tabakasının ve çekirdeğin bulunduğu ön bölgede yoğunlaştığı görülmüştür. Ayrıca, test edilen tüm serbest yaşayan aerobik protozoa türlerinde de floresans saptanmış olup, bu durum ligandın protozoalara özgü genel yapılara bağlandığını göstermektedir. E. coli için herhangi bir ligand bağlanması gözlenmezken, bir mikromolar ligand litik peptit, omo ve yeraltı termit işçilerinin bağırsağından alınan üç protozoa türünü ve ayrıca serbest yaşayan T. piriformis'i in vitro ortamda 10 dakikadan kısa sürede öldürmüş, kontrol grubu ise hayatta kalmıştır.

Bu görüntü, ligandlı litik peptit ile işlem görmüş termit bağırsak protozoalarının membran bütünlüğünün kademeli kaybını göstermektedir. Ligandlı litik peptit ve su tedavileri arasında e coli koloni sayısında herhangi bir fark gözlemlenmemiştir, ancak ligand içermeyen litik peptit e coli koloni sayısını önemli ölçüde azaltmıştır. Bu durum, litik peptite bir ligand eklemenin, hedef dışı mikroorganizmaları belirli bir dereceye kadar lizisten koruduğunu göstermektedir. 500 micromolar ligandlı litik peptitten 0.3 microliters enjeksiyonu, öncü ve yeraltı termitlerinin bağırsağındaki üç protozoa türünün tamamını 24 saat içinde öldürmüştür ve ligand bağlı litik peptit enjekte edildikten 10 gün sonra termitler ölmüştür.

Husen ve Colia 2009'da gösterildiği gibi, ligand konjuge edilmemiş litik peptidler enjekte edildiğinde olduğundan üç kat daha hızlı protozolar ve termitler ölmüştür; bu durum, ligandın optimal kültür koşulları altında litik peptidlerin protozoal sitolitik etkinliğini artırdığını göstermektedir. Omo. subterranean termitlerin bağırsaklarından izole edilen üç protozoa türünün tamamı en az üç gün boyunca canlı ve sağlıklı kalmalıdır.

Ancak, ortamda oksijen kalıntıları kalırsa protozoaların hareketi anında durur. Yanlış ortam kullanılırsa ve hücrelerdeki ozmotik basınç çok yükselirse, protozoaların membranları dışa doğru şişer ve protozoalar parçalanır. Hücrelerdeki ozmotik basınç çok düşerse veya membranlar zarar görürse, protozoalar büzüşür ve küçülür. Protozoaların fikse edilmesi, floresan işaretli ligandın protozoalara bağlanmasının tespit edilmesini kolaylaştırır.

Protozoalar serbestçe hareket halindeyken floresansı tespit etmek ve onu odun parçacıklarının otofloresansından ayırt etmek zordur. Bu teknikten sonra, bir asistan yardımıyla saatte yaklaşık 30 termite enjeksiyon yapılabilir. Ligand kolitik peptit, yeraltı termitlerinin bağırsaklarındaki protosom simbiyontlarını öldürmek ve böylece termit kontrolü sağlamak için geliştirilmiş olsa da, insanlarda birçok hastalığa neden olan slash mania, ponoma, te ve odium gibi protosom parazitlerine karşı ilaçlar geliştirmek için de faydalı olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra; termit bağırsaklarından ekstrakte edilen protozoaların kültürde nasıl elde edileceği ve sürdürüleceği, bir ligandın protozoalara spesifik bağlanmasının floresan mikroskobu ile nasıl gösterileceği, ligand kolitik peptidin in vitro proto-intihar etkisinin nasıl kanıtlanacağı ve son olarak, in vivo doğrulama için termit bağırsağına peptitlerin nasıl enjekte edileceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olacaksınız.