Protozoa Termit Gut Karşı Ligandla litik Peptitler Protozoacidal Aktivitesi Test In vitro (Protozoa Kültür) ve In vivo (Mikroenjeksiyon içine Termit Hindgut)

Bu prosedürün genel amacı, sentezlenmiş ligandların formosa subterranean termitlerin bağırsaklarındaki selülozu sindiren protozoalara spesifik olarak bağlandığını ve litik peptit ile eşleştirilen ligandın bu protozoaları in vitro anaerobik protozoa kültüründe ve in vivo termit arka bağırsağına enjeksiyon yoluyla öldürdüğünü göstermektir. Bu işlem, öncelikle işçi termit bağırsak protozoalarının anaerobik koşullar altında ekstrakte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, floresan eşli bir ligandın termit bağırsak protozoalarına in vitro bağlanmasını doğrulamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, ligandla eşlenmiş litik peptidin termit bağırsak protozoalarını in vitro ortamda öldürdüğünü göstermektir. Prosedürün son adımı ise bağlanmayı ve bağırsak protozoalarının yıkımını in vivo olarak doğrulamak için floresan eşli ligandın ve ligandla eşlenmiş litik peptidin termit arka bağırsağına enjekte edilmesidir. Termit arka bağırsağına yapılan protozoa kültürü enjeksiyonları ve floresan mikroskobu kullanarak, litik peptide eşlenmiş bir ligandın in vitro ve in vivo ortamlarda termit bağırsak protozoalarına bağlandığını ve onları etkili bir şekilde öldürdüğünü gösteriyoruz.

Ligandın litik peptide bağlanması, tek başına litik peptide kıyasla protozoalara karşı toksisiteyi artırmıştır. Ligandın bakteriyel hücre membranına bağlanmaması nedeniyle muhtemelen E. coli gibi hedef dışı organizmalara karşı toksisite azalmış olsa da, protozoaların kaybı termitlerin iki haftadan kısa bir sürede ölmesine yol açmaktadır. Yeraltı termitlerinin bağırsaklarındaki simbiyotik protozoaları öldürmek için LIG litik peptidlerin kullanılmasına yönelik sunulan bu teknik, termit kontrolü için alternatif teknikler geliştirme çabalarının bir parçasıdır.

Bağırsaklarındaki simbiyontlar olmadan kimyasallara daha az bağımlı hale gelen termitler ölür. Ligandın protozoalara bağlandığını ve ligand litik peptidin protozoaları öldürdüğünü göstermek için termit bağırsağından protozoaları ekstrakte ediyoruz. Protozoaların içindeki odun parçacıkları otofloresans gösterir. Bu nedenle, floresan ligand ile işlem görmüş protozoaların sonuçlarını, işlem görmemiş protozoalarla karşılaştırmak önemlidir.

Yanlış pozitiflerin önüne geçmek için peptidleri doğrudan arka bağırsağa enjekte ediyoruz; çünkü peptidlerin termitlere yedirilmesi durumunda, proteaz orta bağırsakta bulunur ve ön bağırsak bunları sindirir. New England Bio Labs'ten temin edilen fage display kütüphanelerini kullanarak, protozoalara bağlanan 19 hep peptid dizisi belirledik. *Trypanosoma brucei* membranından bilinen varsayımsal glikoproteinlerle benzerlikler gösteren peptid dizisine sahip ligandlardan birini seçtik.

Peptit sentezinden sonra, peptit konjugatlarının litik özelliklerini değerlendirmek için E-D-A-N-S novatech reçinesi kullanılarak katı faz peptit sentezi yoluyla sentezlenen peptiti C terminalindeki floresan bir proba bağladık. Bu prosedürde, sentezlenen ligand ile deneyden bir gün önce LSU protein tesisinde sentezlenmiş olan litik peptit ate'nin bir konjugatını kullandık. Kullanılan tüm malzemeleri kaplamak ve protozoaların veya peptitlerin yüzeylere adsorbsiyonunu önlemek için sigma coat kullanın.

Eşit bir tabaka halinde uygulayın ve ertesi gün kullanmadan önce gece boyunca kurumaya bırakın. Nem ve oksijen seviyelerini bir saatten fazla süreyle düşürmek için, oda sıcaklığındaki havayı bir kurutucu ve tip D katalizör yığın paketleri üzerinden sürekli olarak dolaştıracak bir fan kutusunu glove box içerisinde hazırlayın. Glove box'ı 20 ila 30 dakika boyunca sürekli bir nitrojen akımıyla doldurun ve gerektiğinde anaerobik koşulları korumak için ek nitrojen kullanın.

Ardından, Traeger U medyası hazırlayın ve pH değerini yediye ayarlayın; eldiven kutusundaki oksijen kalıntılarını gidermek için %2,5 hidrojen, %5 karbondioksit ve %92,5 azot karışımına sahip bir tüpe bağlı 200 µL uç aracılığıyla sterilize edilmiş medyayı filtreleyin ve bir saat boyunca bekletin. Materyaller hazır olduğunda, bir Petri kabından bir termit işçisini almak için pens kullanın ve termiti pensle yaklaşık 10 saniye boyunca nazikçe tutarak tüm vücudunu %70 etanol ile dolu bir behere daldırın. Yüzey kontaminantlarını temizlemek için işçiyi etanolden çıkarın ve temiz bir Kim wipe üzerinde yaklaşık 20 saniye boyunca kurumaya bırakın.

Eldivenli kutu (glove box) içerisinde, termit bağırsağını toplamak için 100 µL Trager U medyumu içeren silanize edilmiş bir mikroskop lamı ve protozoaları toplamak için 900 µL Trager U medyumu içeren bir tüp hazırlayın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu ve bir çift steril ince uçlu pens kullanarak işçi termitin abdomenini tutun ve diğer pensle abdomenin ucunu kavrayarak bağırsağı nazikçe 45 derecelik bir açıyla yukarı veya aşağı doğru çekin; orta bağırsak ve arka bağırsak dahil olmak üzere dört bağırsak parçasını tek parça halinde toplamaya çalışın. Toplanan termit bağırsaklarını, mikroskop lamı üzerindeki 100 µL'lik bir Trager U medyumu damlasının içine yerleştirin.

Ardından lamı kaydırın, protozoaları serbest bırakmak için arka bağırsakları bir çift steril ince diseksiyon probu ile delin ve bağırsak içeriğini 200 µL'lik bir pipetle, içerisinde 900 µL Traeger medyumu bulunan bir mililitrelik mikro santrifüj tüpüne nazikçe aktarın. Bağırsak duvarı parçalarının çökelmesi için beş saniye bekleyin ve süpernatantın 900 µL'sini yeni bir tüpe aktarın. Protozoa kültüründen 10 µL'yi sigma kaplı bir mikroskoba aktarın.

Lamı yerleştirin ve protozoaların durumunu bir mikroskop altında 200 kat büyütmede kontrol edin. Protozoaları elde ettikten hemen sonra; aerobik protozoalar, tetra piriformis, amoeba, ug, gleaner ve paramecium için kontrol kültürlerinin yanı sıra, tedarikçinin önerdiği kültür ortamında e coli'nin gece boyu kültürünü hazırlayın; sabitlenmiş termite gut protozoalarını ve diğer tüm protozoan kontrollerini ve e coli'yi %10 formaldehit ile dört derece Celsius'ta 12 saat boyunca bekletin. Ardından, protozoa çözeltisini 30 ×g hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve fikse edilmiş protozoaları içeren peleti bir mililitre Trager U medyum ile iki kez yıkayın, peleti bir mililitre Traeger Edia içinde süspande edin ve fikse edilmiş mikroorganizmaları, suda çözünmüş 50 mikromolar ligand nihai konsantrasyonunda, floresan boya E-D-A-N-S'e bağlanmış sentezlenmiş ligand çözeltisinin 100 mikrolitresi ile bir ila iki saat inkübe edin. Ligandlarla işlem görmüş mikroorganizmaları ve işlem görmemiş kontrolleri, 400 kat büyütmede, 341 nanometrede maksimum absorbans ve mavi bölgede 471 nanometrede emisyon ile floresan mikroskop altında gözlemleyin.

Ligand konjuge litik peptidin özelliklerini değerlendirmek için, üçüncü bölümde gösterildiği şekilde hazırlanan protozoa kültüründen 198 µL'lik altı alikotu 0,5 mL'lik eppendorf tüplerine pipetleyin. Termit bağırsağı protozoa kültürü alikotlarının yarısına, 100 µM'lık bir ligand litik peptid çözeltisinden 2 µL ekleyin. Nihai konsantrasyonun 1 µM olması için, diğer yarım alikot grubuna kontrol olarak 2 µL steril su ekleyin.

Bir saat sonra, her bir protozoa kültüründen 10 µL'yi bir lama aktarın. Ligand konjuge litik peptid ile işlem görmüş protozoaların sağkalımını, kontrollerinkilerle karşılaştırmak için 200 kat büyütme altında mikroskopla inceleyin; çift aşamalı ısı seviyesine sahip bir NGI PC 10 mikropipet çekicisi kullanarak iğneleri çekin. 20 ila 30 mikron boyutunda bir uç elde etmek için, uç boyutunu mikroskop altında ölçerek doğrulayın.

Bir mikrometre kullanarak, bir iğneyi su içerisinde süspande edilmiş yaklaşık 30 µL 50 µM floresan işaretli ligand ile doldurun. Kontrol için başka bir iğneyi ek bir şırınga kullanarak su ile doldurun. Bir mikro pipeti bir tutucuya ve bir mikro manipülatöre sabitleyin. Bir iğneyi, ikinci bir mikro manipülatördeki enjeksiyon sistemi tutucusuna sabitleyin.

Başlangıç enjeksiyon parametrelerini yaklaşık bir saniye darbe uzunluğu ve 10 ila 12 PSI enjeksiyona ayarlayın. Ardından iğneyi yavaşça mikro pipete ilerletin ve enjeksiyondan sonra bir ayak pedalı kullanarak çözeltiyi enjekte edin. Mikro pipeti çıkarın ve enjekte edilen çözeltinin uzunluğunu kaydedin.

Bir kumpas kullanarak, mikro pipetin bilinen parametrelerinden enjekte edilen hacmi hesaplayın ve 0,3 microliters çözelti püskürtmek için basıncı ve pals uzunluğunu ayarlayın. Ardından, her bir uygulama için enjeksiyon amacıyla 20 termit hazırlayın. Öncelikle, rektumda bulunan herhangi bir boşaltımı uzaklaştırmak için abdomenin ucunu yumuşak pensle sıkın.

Ardından, termitler hareketsizleşene kadar beş dakika boyunca buz üzerinde soğutarak termit işçilerini immobilize edin. 100 µL pipet uçlarını keserek termit işçilerini tutmak için alıcılar hazırlayın. Bir skalpel bıçağı kullanarak ucu 10 ila 12 mm uzunluğunda kesin, termitlerin boyutuna göre kullanın ve bunları bir viyale yerleştirin.

Alıcıyı, vidalı bir kapakla mikro manipülatöre sabitleyin. Bir işçiyi, sırtı aşağı gelecek şekilde bir Petri kabına yerleştirin ve azot vakum pompası kullanarak işçiyi baş kısmından alıcıya doğru aspire edin; böylece işçinin uç kısmı alıcının dışına çıkmış olur. Termiti alıcıda dikkatlice tutarak, doldurulmuş iğneyi mikro manipülatör yardımıyla ilerletin ve işçinin anüsüne yerleştirin. 0.3 µL floresan işaretli ligand veya su kontrolü enjekte edin.

Ligand veya su enjekte edilen işçileri, nemli filtre kağıdı içeren ayrı Petri kaplarına yerleştirin ve 26 °C sıcaklıkta, %78 bağıl nemde gece boyunca bekletin. 24 saat sonra, enjekte edilen termitlerin bağırsaklarını çıkarın ve protozoaları daha önce gösterildiği şekilde toplayın. Canlı termitlerde ligand konjuge litik peptidlerin litik özelliklerini değerlendirmek için, enjekte edilen termitlerden alınan protozoalardaki ligand bağlanmasını floresan mikroskobu kullanarak gözlemleyin.

Enjeksiyon materyallerini, ekipmanları ve termitleri daha önce enjeksiyonlar için yapıldığı şekilde hazırlayın ve 20 termit işçisinin arka bağırsağına 0,3 µL 500 µM ligand litik peptit çözeltisi veya kontrol olarak su enjekte edin. 24 saat sonra, birkaç işçinin bağırsaklarını çıkarın ve mikroskop altında 200 kat büyütmede bağırsak içeriğini gözlemleyin; işlem görmüş termit bağırsağındaki tüm protozoaların ölümü doğrulandığında işlemi tamamlayın. Kalan işlem görmüş termitleri ve kontrolleri, nemli filtre kağıdı bulunan Petri kaplarında tutun ve mortaliteyi günlük olarak gözlemleyin. Floresan proba bağlanmış ligandın p grassi, h heart mani ve sla protozoa türlerinin üçüne de bağlandığını onaylıyoruz.

Dört mosson yer altı termitinin arka bağırsağından elde edilen tespit edilebilir yoğunluklardaki ligand bağlanması, tüm hücre yüzeyinde gerçekleşmekte ve protozoanın ekseni üzerindeki, mikrotübül tabakası ve çekirdek MP grass eye ile çevrili ön bölgesinde yoğunlaşmaktadır. Ayrıca, test edilen tüm serbest yaşayan aerobik protozoa türlerinde de floresans tespit ettik; bu durum, ligandın protozoalara özgü genel yapılara bağlandığını göstermektedir. E coli için herhangi bir ligand bağlanması gözlemlenmezken, bir mikromolar ligand litik peptit, omo ve yer altı termit işçilerinin bağırsağından alınan üç protozoa türünün tamamını ve ayrıca serbest yaşayan tea piriformis'i in vitro ortamda 10 dakikadan kısa sürede öldürmüş, kontrol grubu ise canlı kalmıştır.

Bu görüntü, ligand lytic peptid ile işleme tabi tutulmuş termit bağırsak protozoalarının membran bütünlüğünün aşamalı kaybını göstermektedir. Ligand lytic peptid ve su uygulamaları arasında e coli koloni sayısında bir fark gözlemlenmemiştir; ancak ligandsız lytic peptid, e coli koloni sayısını önemli ölçüde azaltmıştır. Bu durum, lytic peptide bir ligand eklemenin, hedef dışı mikroorganizmaları bir dereceye kadar lizisten koruduğunu göstermektedir. 500 micromolar ligand lytic peptidden 0.3 microliters enjekte edilmesi, 24 saat içinde foremost ve yeraltı termitlerinin bağırsaklarındaki üç protozoa türünün tamamını öldürmüştür ve ligand bağlı lytic peptid enjekte edildiğinde termitler 10 gün sonra ölmüştür.

Husen ve Colia 2009'da gösterildiği üzere, protozoalar ve termitler, ligand konjuge edilmemiş litik peptitler enjekte edildiğine kıyasla üç kat daha hızlı ölmüştür; bu durum, ligandın optimal kültür koşulları altında litik peptitlerin protozoal sitidal etkinliğini artırdığını göstermektedir. Omo. Subterranean termitlerin bağırsaklarından izole edilen her üç protozoa türü de en az üç gün boyunca canlı ve sağlıklı kalmalıdır.

Ancak, besiyerinde oksijen kalıntıları kalırsa, protozoaların hareketi hemen durur. Yanlış besiyeri kullanılırsa ve hücrelerdeki ozmotik basınç çok yükselirse, protozoaların membranları dışarı doğru şişer ve protozoalar parçalanır. Hücrelerdeki ozmotik basınç çok düşerse veya membranlar zarar görürse, protozoalar büzüşür ve küçülür. Protozoaların fikse edilmesi, floresan eşli ligandın protozoalara bağlanmasının tespit edilmesini kolaylaştırır.

Protozoalar serbestçe hareket ederken floresanlığı tespit etmek ve bunu odun parçacıklarının otofloresansından ayırt etmek zordur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, bir asistan yardımıyla saatte yaklaşık 30 termit enjekte edilebilir. Ligand kolitik peptid, yeraltı termitlerinin bağırsaklarındaki protosom simbiyontlarını öldürmek ve böylece termit kontrolü sağlamak için geliştirilmiş olsa da; insanlarda birçok hastalığa neden olan slash mania, ponoma, te ve odium gibi protosom parazitlerine karşı ilaçlar geliştirmek için de faydalı olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, termit bağırsaklarından ekstrakte edilen protozoaların kültürde nasıl elde edileceği ve sürdürüleceği, bir ligandın protozoalara spesifik bağlanmasının floresan mikroskobu aracılığıyla nasıl gösterileceği, ligand kolitik peptidin in vitro proto-intihar etkisinin nasıl kanıtlanacağı ve son olarak, in vivo doğrulama için termit bağırsağına peptitlerin nasıl enjekte edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.