Kornea Konfokal Mikroskop: Periferik Nöropatiler Küçük Fiber Patoloji belirlememize • Bir Roman Non-invaziv Tekniği

Bu video, sinir lifi hasarının miktarının belirlenmesine olanak tanıyan korneal konfokal mikroskopi (CCM) invaziv olmayan tekniği kullanılarak korneal C liflerinin görüntülenmesi prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, CCM üzerindeki lensin odak düzlemi ayarlanır ve tek kullanımlık kapak takılmadan önce lense visko gözyaşı jeli uygulanır. Ardından göze anestezik damlalar ve visko gözyaşı jeli uygulanır.

Ardından, lensin önündeki jel ile hastanın korneası arasında temas sağlamak için kamera ayarlanır. Son olarak, odak düzleminin derinliği ayarlanır ve Bowman tabakasının merkezi kısmındaki kornea sinirlerinin görüntüleri alınır. Kornea sinir liflerindeki morfolojik değişiklikler, nöropatiyi nicelleştirmek için gözlemlenebilir.

Bu, aslında daha önce optometri ve oftalmoloji dünyasında kullanılmış olan oldukça yeni bir tekniktir; ancak son sekiz yıl civarında, diyabetik nöropatiyi ve diğer periferik nöropatileri incelemek ve değerlendirmek için bu yöntemi çok etkili bir şekilde kullandık. Bu tekniğin temel avantajı, küçük lif hasarının çok erken bir aşamada nicelleştirilmesine olanak tanıması ve ardından hastalardaki nöropati şiddetini tamamen non-invaziv bir şekilde sınıflandırmayı sağlamasıdır; bunu, nöropati şiddeti açısından nicelleştirilebilen iki dakikalık bir tarama ile çok hızlı bir şekilde gerçekleştirebiliriz ve bu sayede, deri biyopsisi ve sinir biyopsisi gibi çok daha invaziv olan diğer bazı tekniklerin yerini almasını umuyoruz. Genel olarak basit bir teknik gibi görünse de, aslında görüntüyü optimal şekilde yakalamanızı ve ardından görüntüyü nicelleştirmenizi sağlayan belirli adımlar gerektirmektedir.

Ve gerçekten, bu tüm süreci bu tekniği kullanmak isteyebilecek diğer herkes için açık ve belirgin hale getirmek istiyoruz. HRT kornea konfokal mikroskobu kullanılarak yapılan incelemedeki ilk adım, lazer tarama kamerasının objektif tüpündeki objektif lens ucunun hazırlanmasıdır. Kırılmayı +12 diyoptre olarak ayarlayın, ardından kamerayı en düşük konuma getirin ve lensi saat yönünün tersine döndürerek kilitleyin.

Lens ucuna, büyük, homojen, hava kabarcıksız, P boyutunda bir damla visco tears uygulayın. Bir tomo kapağını steril kabından çıkarın ve, jel objektif lens ile kap arasında bir menisküs oluşturacak şekilde, tutucu üzerinden mümkün olduğunca ileriye, lens ucunun üzerine yerleştirin. Montaj sırasında tomo kapağının ön yüzeyine dokunmamaya dikkat edin.

Şimdi, lazer tarama kamerasını kamera braketi üzerinde mümkün olduğunca geriye çekerek tomo kapağının iç ve dış yüzeyini görüntüleyin. Her ikisi de ekran monitöründe parlak bir lazer yansıması olarak görünür. Lensin kapağın ön kısmına odaklandığını belirten parlak bir yansıma gözlemlenene kadar odak düzlemi ayar tekerleğini çevirin.

Odak konumu ekranında görünen derinlik değeri şu anda -150 µm ile +150 µm arasında olmalıdır. Derinlik ayarını sıfıra getirin. Şimdi hastanın nasıl hazırlanacağını görelim.

Deneklerin gözleri %0,4 atropin hidroklorür damlası ile anestezi edildikten sonra, gözün ön kısmı visco tears ile kayganlaştırılır. Deneği, alnının alın barına sıkıca dayandığından emin olarak, çenesi çene desteğinde rahat bir şekilde konumlandırın. Hastanın dış fiksasyon ışığına odaklanması sağlanarak muayene kolaylaştırılır.

İncelenmeyen göz söz konusu olduğunda, mikroskop başlığının kompakt boyutu deneğin karşı tarafındaki gözünün kapanmamasını sağlar. Bu durum, mesafe hedeflerinin kullanılmasına olanak tanır. CCD kamerayı, optik erişimi lazer tarama kamerasının optik erişimine dik olacak şekilde konumlandırın.

Sağ göz görüntülenirken kamera hastanın sağ tarafında, sol göz görüntülenirken ise sol tarafında olmalıdır. Bu konumda, tomo kapağının ön yüzeyi CCD kameranın merkezinde görülür. Canlı görüntü.

Lazer tarama kamerasını, hastanın korneası tomo başlığından yaklaşık beş ila 10 milimetre uzaklıkta olana kadar hastaya doğru hareket ettirin. Ardından, tomo başlığı hastanın korneasının merkezine yerleşene kadar kamera tutucusundaki dikey ve yatay erişim ayar düğmelerini kullanarak lazer tarama kamerasını yukarı-aşağı ve sağa-sola hareket ettirin. Şimdi hastadan gözlerini mümkün olduğunca geniş açmasını isteyin.

Lazer tarama kamerasını, tomo kapağı hastanın korneasına temas edene kadar yavaşça hastaya doğru hareket ettirin. Bu aşamada, kırmızı lazer ışığının korneanın merkezinde olduğunu ve lazer ışınının korneadan yansımasının tam olarak korneanın ön kutbunda gerçekleştiğini kontrol edin. Optimal ayarlamada, lens ile kornea arasında minimum temas bulunur.

Tomo kapak ile kornea arasında ince bir jel köprüsü CCD kamera canlı görüntüsünde görünür. Tomo kapak ile kornea arasında çok fazla basınç varsa, CCD kamera üzerinden korneada düzleşmiş bir görünüm oluşur. Canlı görüntü ve sapmalar CCM görüntüsünde belirir.

Hastayı ayarladıktan sonra HR üç lazer kamerasını açın; ekran üzerinde görüntüleme penceresi görünecektir. Tomo başlığını ve lazer ışığını hastanın korneası üzerinde konumlandırmak için CCD görüntüsünü kullanın. CCM'de görüntü yakalama için üç seçenek bulunmaktadır.

Sıralı tarama, ayarlanabilir bir kare hızıyla 100 adede kadar görüntünün alınmasını sağlar. Saniyede 1 ile 30 arasında bir kare hızı seçilir. Buna bağlı olarak, süresi 3 ile 100 saniye arasında olan bir video kaydedilebilir.

Hacim tarama modunda, kamera ardışık odak düzlemlerinde otomatik olarak 40 görüntüden oluşan bir seri alır. Toplam 85 mikrometre derinlik taranabilir ve iki ardışık görüntü arasındaki odak mesafesi yaklaşık 2,1 mikrometredir. Son seçenek, bu deneyde kullanılacak olan kesit modudur.

Bu mod, ayak anahtarına her basıldığında elde edilen ve kaydedilen net tekil görüntülerle optimal görüntülemeyi sağlar. Bu mod, korneanın merkezindeki Bowman tabakası da dahil olmak üzere tüm kornea tabakasından görüntü almak için kullanılır. Yeterli sayıda görüntü alındıktan sonra, sekans ve hacim modları da dahil olmak üzere diğer modlar kullanılabilir.

Birkaç taramadan sonra, epitel hücre tabakasını odağa getirip ardından derinlik değerini sıfıra ayarlamak için sıfırlama düğmesine tıklayarak, lensin odak düzlemi değiştirilip kornea hücre tabakasının derinliği kornea yüzeyine göre ölçülebilir. İnceleme tamamlandıktan sonra, görüntüleme penceresindeki kamera güç düğmesine tıklayarak kamerayı kapatın. Hastaya, lokal anestezinin etkisi geçene kadar gözlerini ovuşturmaması gerektiğini bildirin.

Kameradaki tomo kapağını çıkarıp atın ve ardından mikroskop lensini distile su ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla temizleyin. Şimdi, mevcut incelemeleri gözden geçirmek ve analiz etmek için bir görüntünün nasıl analiz edileceğini ve sinir lifi parametrelerinin nasıl nicelleştirileceğini görelim. Öncelikle, veri tabanı penceresinden uygun hasta kaydını seçin.

Görüntü görüntüleme penceresi, seçilen hastaya ait mevcut kornea incelemelerinin genel bir görünümünü sunar. Farklı günlerde gerçekleştirilen incelemeler, ayrı ziyaret sekmelerinde saklanır. Üç farklı tarama türü, üç farklı simge ile temsil edilir. Heidelberg Eye Explorer'ın görüntü görüntüleme penceresindeki HRT üç kornea ziyaret sekmesi.

Kornea görüntüsünü incelemek için uygun görüntü simgesine çift tıklayın ve ardından daha ileri analizler için ilgili görüntüleri dışa aktarmak amacıyla şimdi göster (show now) butonuna basın, araç çubuğundaki dışa aktar (export) seçeneğine tıklayın ve ardından görüntüleri kaydetmek için klasörü seçin. Bu araştırmanın ana odak noktası Bowman tabakası ve kornea sinirleri olduğu için sadece bu tabakaya ait görüntüler analiz edilecektir. Her denek için korneanın farklı derinliklerinden Bowman tabakasından beş ila altı kare seçilir.

Görüntü analizi, grubumuz tarafından geliştirilen CCM Image Analysis Tools adlı yazılımın 0.64 versiyonu ile gerçekleştirilir. Kornea sinirleri için temel parametreler, kare başına düşen ana sinir sayısı olarak tanımlanan sinir lifi yoğunluğu yazılımı ile ölçülür. Sinir dal yoğunluğu ise kare başına düşen toplam ana dal sayısıdır.

Sinir lifi uzunluğu, çerçeve sinir lifi başına ana sinirlerin ve ana dalların toplam uzunluğudur. Kıvrımlılık, çerçeve başına ana sinirlerin kıvrımlılığıdır. Bir CCM görüntüsünü açmak için dosya menüsüne gidin ve ardından aç'ı seçin.

Görüntü yüklendikten sonra, boyut ve türü kontrol panelinin sol üst köşesindeki görüntü bilgi kutusunda görüntülenir; varsayılan ölçek ise görüntü bilgisinin düzenleme satırında gösterilir. Ölçek farklıysa, düzenleme satırındaki sayıyı değiştirin. Görüntüyü analiz etmeye başlamak için, kontrol panelinin sağ üst köşesindeki metrik kutusundan ölçmek istediğiniz parametreyi seçin.

Sayfanın altındaki sonuç kutusunda, NFD ve MBD gerçek bir sayı olarak sunulur. NFL milimetre cinsinden, tortuosity ise bir tortuosity katsayısı olarak sunulur. Sonuçlar bir Excel sayfasına aktarılabilir.

Excel sayfasını açtığınızda sonuçlar; NFD için milimetrekare başına sayı, NFL için milimetrekare başına milimetre ve NFT için tortuozite katsayısı şeklinde sunulacaktır. Bu ölçümleri yapmak için önce her bir ana siniri, ardından her bir ana sinir dalını işaretleyerek başlayın. Son olarak, çerçevedeki her bir sinirin üzerinden geçerek iz sürün.

Daha yüksek doğruluk için dijital bir kalem kullanılabilir. Bu prosedür uygulanırken teknik doğru şekilde icra edilirse, uzmanlaşıldığında işlem bir dakika içinde tamamlanabilir. Detaylandırılan talimatlara uymak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kornea konfokal mikroskopi ile korneanın hareket tabakasından nasıl çalışılacağı ve görüntüler alınacağı ile periferik nöropatiye, özellikle de diyabetik nöropatiye sahip hastalarda bu tabakadan alınan görüntülerin nasıl nicelleştirileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Ayrıca, CCM ile çalışmanın uzmanlık gerektirdiğini ve prosedürün göz muayenesi konusunda eğitim almış profesyoneller tarafından yürütülmesinin önerildiğini unutmayın.