Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi

Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.

Bu prosedür, yarı katı bir ortamda, hematopoietik progenitörlerin kültüre başlamak için farklı hematopoietik soylar boyunca çoğalma ve farklılaşma yeteneğini değerlendirir. İki gün sonra aktivasyonu teşvik etmek için sitokinlerin varlığında taze çözülmüş CD 34 pozitif hücreler. Aktive edilmiş CD 34 pozitif hücreleri virüsle önceden yüklenmiş bir plakaya ekleyerek bir GFP eksprese eden test yapısının retroviral transdüksiyonunu gerçekleştirin.

48 saat sonra GFP pozitif hücreleri faksla izole edin, daha sonra bu hücreleri büyüme faktörleri ile takviye edilmiş yarı katı metilselüloz ortamda kaplayın, yüzeyde koloniler görünene kadar yaklaşık iki hafta inkübe edin. Son olarak, kolonileri hasat edin, sitozin kullanarak hücreleri slaytlar üzerinde hareketsiz hale getirin ve hematopoietik soyun ve olgunlaşma aşamasının mikroskobik olarak belirlenmesi için sağ giza ile boyayın. Bu yöntem, lösemogenez çalışmalarında, yani onkogenlerin hematopoietik farklılaşma üzerindeki etkilerinde mekanik içgörü sağlayabilir.

Bir kültürü görmek için, donmuş CD 34 pozitif hücrelerden oluşan bir şişeyi 37 santigrat derecede son küçük buz kristali kalana kadar hafifçe sallayarak hızlı bir şekilde çözün ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Şişeden kalan hücreleri bir mililitre oda sıcaklığında, %2 F-B-S-I-M-D-M ortamı ile nazikçe durulayın ve hafifçe döndürürken 50 mililitrelik tüpe damla damla ekleyin. Şimdi üç dakika bekleyin.

Yavaşça karıştırırken iki mililitre ortam ekleyerek devam edin ve tekrar üç dakika dengeleyin. Hücreleri toplamak için seyreltilmiş hücre süspansiyonuna üç dakikalık aralıklarla eşit hacimli ortam ekleme prosedürünü tekrarlayın, son hacim 32 mililitreye ulaşana kadar eklemeler arasında hafifçe döndürün, hücreleri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 G'de santrifüjleyin ve süpernatı çıkarın, peletin üzerinde yaklaşık 0.5 mililitre ortam bırakın. Peleti 20 mililitre ortamda süspanse ederek ve 200 G'de sekiz dakika santrifüjleyerek hücreleri bir kez yıkamaya devam edin Oda sıcaklığında, aklı çıkarın, ve hücreleri mililitre başına yaklaşık yarım milyon hücrede tam IMDM ortamında askıya alın.

Son olarak, hücre konsantrasyonunu belirlemek için, 10 mikrolitre süspansiyonu aynı hacimde% 0.4 trian mavisi çözelti ile karıştırılmış bir mikro tüpe alın ve sayın. Bir hemo sitometre kullanarak, aktive edici sitokin kültürü karışımı ile desteklenmiş tam IMDM ortamı ekleyerek hücreleri mililitre başına 10 ila beşinci hücreye seyreltin, hücreler iki gün boyunca% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş 37 derece Santigrat inkübatörde hücreler, transdüksiyon gününde 24 iyi tedavi edilmemiş doku kültürü plakasını preco etmek için hazırlanacak kuyucuk sayısını belirlemek için virüs ön yüklemesine başlamadan önce hücreleri sayın. Her bir oyuğa mililitre başına 25 mikrogram 400 mikrolitre, retro aktin çözeltisi ekleyin ve laminer akış biyogüvenlik başlığında oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Retro aktin çözeltisini çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek her bir kuyucuğu %2 BSA ile kodlayın. Bu arada, virüs stok çözeltilerini çözün ve buz üzerinde saklayın. Daha sonra, her bir oyuğa 0.5 mililitre virüs preparatı ekleyerek BSA çözelti yükü virüsünü aspire edin ve 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 2.200 G'de santrifüjleyin.

Virüs çözeltisini kuyulardan çıkarın ve virüs yüklemesini üç kez daha tekrarlayın. Son olarak, her bir kuyuyu soğuk IMDM ortamı ile durulayın. Şimdi önceden aktive edilmiş CD 34 pozitif hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, sitokin alikotu 0.15 milyon CD 34 pozitif hücre ile takviye edilmiş taze tam IMDM ortamında, virüs kodlu kuyucukların, kuyuların her birine yeniden süspanse edin ve nemlendirilmiş bir 37 derece Santigrat inkübatörde iki gün boyunca% 5 karbondioksit ile inkübe edin.

Hücreleri virüsün yüzdürdüğü plakalardan askıya alın ve süspansiyonu 50 mikronluk bir hücre filtresinden konik bir tüpe süzün. 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir mikro tüpe alın. Eşit hacimde trian mavisi çözelti ile karıştırın ve bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.

Her bir kuyucuğu% 0.02 EDTA'lı 0.8 mililitre soğuk HBSS ile durulayın ve 50 mikronluk bir CEL Trix hücre filtresinden geçen aynı toplama tüpüne ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve bir kez soğuk HBSS ile yıkayın. HBSS'deki son hücre peletini %1 BA ile yeniden askıya alın ve tipik olarak deneysel tasarıma dayalı yüksek hızlı bir hücre sıralayıcı çekirdek tesisinde gerçekleştirilen sonraki hücre sıralaması için hücreleri karanlıkta buz üzerinde tutun.

Karıştırmak için gerekli sayıda CFC tahlil ortamı girdabını kuvvetlice çözün ve hücreleri eklemeden önce kabarcıkların yüzeye çıkmasına izin vermek için tüpün en az beş dakika bekletilmesine izin verin. Şimdi 3000 virüs transdüksiyonlu sıralanmış hücreyi soğuk% 2 F-B-S-I-M-D-M ortamı içeren steril bir mikro tüpe alın ve son süspansiyon hacmini 0.3 mililitreye ayarlayın. Hücreleri askıya alın ve tüm hücre süspansiyonunu üç mililitrelik bir metil kült büyüme Ortamına aktarın.

Kuvvetli bir şekilde girdap yaparak homojen bir hücre süspansiyonu oluşturun. Tüpü üç dakika hareketsiz bırakın. Hücreleri plakalamak için, üç mililitrelik bir şırıngaya 16 gauge künt uçlu bir iğne takın ve 2.2 mililitre çekin.

Büyük kabarcıkların alımını önlemeye dikkat ederek, her biri 1.1, mililitreyi iki adet 30 milimetrelik işlenmemiş doku kültürü kabına itin ve bir su kabı ile birlikte 100 milimetrelik bir plakaya çift plakaları döndürerek karışımı eşit şekilde yayın. İki hafta boyunca üç litre steril su kültürüne devam edin. Bir puanlama ızgarası ile işaretlenmiş bir kültür kabında 40 x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop ile kolonileri morfolojilerine göre karakterize edin ve puanlayın.

Kültür sonuçlarını belgelemek için, 600 DPI'da normal bir tarayıcı kullanarak tüm CFC test plakasını tarayın ve farklılaşma ve proliferasyonun daha fazla analizi için renkli bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak temsili kolonilerin düşük güçlü fotoğraf mikrograflarını çekin Tüm CFC test plakasından hücreler, morfolojik analizler için yıkanan ve sayılan %2 F-B-S-I-M-D-M oda sıcaklığında birkaç hacim askıya alınarak geri kazanılır. CFC tahlil plakalarından geri kazanılan 30.000 hücreyi bir slayta aktarın. Bir STOs spin santrifüjü kullanarak, slaytları verimli bir şekilde lekelemek için slaytları gece boyunca havayla kurutun.

Aşağıdaki sırayla çözeltiler içeren dokuz boyama kabından oluşan bir montaj hattı kurun. Mutlak metanol, sağ gemsa stok çözeltisi, sağ gemsa tamponu, %50 metanol ve su, iki kap su, fosfat tamponu, pH altı ve son olarak iki kap su. Slaytları bir slayt taşıyıcıya yerleştirin ve iki dakika boyunca mutlak metanole batırın ve fazla metanolün kanını alın.

Slayt taşıyıcıyı hemen daldırın ve beş dakika boyunca gemsa stok çözeltisini yazın. Taşıyıcıyı sağ gemsa tamponu pH 6.4'e aktarın ve 10 dakika inkübe edin. Taşıyıcıyı iki kez% 50 metanole, 10 kez suya ve bir sonraki su kabına 10 kez ve ardından beş kez fosfat tamponuna batırın.

pH 6.0'dır. Taşıyıcıyı suya aktarın ve iki dakika inkübe edin. Yıkamayı son su kabında tekrarlayın.

Şimdi slaytların taşıyıcıda tamamen kurumasına izin verin. Her slaytı çıkarın ve lekeleri çıkarmak için slaytın arkasını metanole batırılmış Kim mendilleriyle silin. Bir damla cyto seal 60 ve kapatmak için bir kapak camı yerleştirin.

Bir mikroskop kullanarak her GM sürekli slayt için 500 hücre diferansiyel sayımı gerçekleştirin. Bu deneyin amaçları doğrultusunda hücreler, ilkel hücreler, ara miyeloid hücreler, olgun miyeloid hücreler, ara eritroid hücreler ve olgun eritroid hücreler olmak üzere beş kategoriye ayrılır. Örneğin, yeni 98 şahinin kontrol ekspresyonu ile karşılaştırıldığında, dokuz onkogen, kırmızı eritroid kolonilerinin oluşumunu arttırdı.

Onkogenin bu pazar etkisi, koloniler düşük büyütme altında gözlemlendiğinde açıkça görülmektedir. GEM sürdürme ile daha fazla morfolojik inceleme, hücre popülasyonunun soyu ve olgunlaşma derecesi hakkında bilgi sağlar. Bu örnekte, yeni 98 Hawks'ın tanıtılması, bir dokuz, eritroid hiperplazisi olan hücrelerin sayısında genel bir artışa neden oldu ve hem eritroid hem de miyeloid olgunlaşmasının inhibisyonunu inhibe etti.

Bu SA, bir giriş hücresi preparatının yarı katı bir ortamda çoğalma, farklılaşma ve koloniler oluşturma yeteneğini ölçerek hematopoietik hücre farklılaşması hakkında bilgi sağlar.