Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

Ben George Dimopoulos ve şimdi size Aidas GTI sivrisineğini dang virüsü ile nasıl enfekte edeceğinize dair bir prosedür göstereceğiz. Ve yapmamız gereken ilk şey, virüsü bir Aidas Aus hücre hattında yaymak. Benim adım Jose Luis Ramirez ve ous Laboratuvarı'nda doktora öğrencisiyim.

Bu prosedür için, 2 santigrat dereceye ayarlanmış bir CO37 inkübatörü olan doku kültürü başlıklı bir BSL iki Tesisine ihtiyacımız olacak. 50 ml'lik plastik konik tüplere ihtiyacımız var. İnsan serumuna ihtiyacımız var, su banyosuna, 37 santigrat dereceye, santrifüje ihtiyacımız var.

96 kuyulu plakaya ve diğer standart moleküler biyoloji ve biyokimyaya, reaktiflere ve sarf malzemelerine ihtiyacımız var. Yani bu, bir BSL iki tesisindeki normal bir doku kültürü başlığıdır ve ilk adım, 75 santimetrekarelik bir şişede %80 co akıcılığına ulaşan hücreleri çıkarmaktır. Bu, %10 ısı, ısı ve %1 L-glutamin ve esansiyel olmayan amino asitlerle desteklenmiş aktif fetal sığır serumu içeren bir MEM ortamıdır.

Tamam, şimdi hücrelere Dang virüsünü ekleyeceğiz. Eksi 80 derecelik dondurucudan virüs stoğunu çıkardık ve 37 derecelik kuvözde çözdürdük. Hücre başına yaklaşık 1,5 virüs partikülü konsantrasyonu elde etmek için hücrelere yaklaşık 0,5 mililitre stok virüs ekliyoruz.

Hücreler daha sonra yavaş bir çalkalama hızında yaklaşık 15 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirilir. Daha sonra, hücreler yaklaşık 45 dakika boyunca bir CO2 inkübatöre yerleştirilir. 37 santigrat derecede, CO2 konsantrasyonu% 5'tir. 45 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri çıkaracağız ve 30 ml ortam ekleyeceğiz ve ardından hücreleri tekrar inkübatöre yerleştireceğiz ve beş gün daha inkübe edeceğiz.

Şimdi virüs parçacıklarını enfeksiyon için hazırlayacağız. İlk olarak, hücreleri bir sıyırıcı ile şişeden ayırmamız ve daha sonra bunları bir ortamla birlikte 50 ml'lik konik bir tüpe aktarmamız gerekiyor. Şimdi onları pelet yapmak için 10 dakika boyunca 12.000 RPM'de santrifüj hücrelerimiz var.

Bu şişenin dibinde peleti görebilirsiniz. Daha sonra, süpernatanı çıkaracağız ve virüsü hücrelerden serbest bırakmak için hücrelerle sadece bir ml bırakacağız. Onları donduracağız.

Bu, hücreleri parçalayacak ve sonra onları çözeceğiz ve sonra tekrar donduracağız ve bu işlemi üç ila dört kez tekrarlayacağız ve dondurma kuru buz üzerinde yapılacak. Dondurulduktan sonra, hücre peleti çözülmesi için 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirilir ve daha sonra her dondurma adımı arasında kuru gözler üzerinde tekrar dondurulur, WEP hücreleri girdap yoluyla askıya alır. Şimdi süpernatan içeren virüsü topluyoruz ve bunu yine virüs parçacıkları içeren önceki santrifüjden süpernatana ekliyoruz.

Bu virüs preparatı artık eşit miktarda tam insan kanı ve serumu ile birleştirilmeye hazırdır. Burada virüs preparatını %15 insan serumu ile desteklenmiş tam insan kanı ile birleştirdik. Bu kan virüsü çözeltisi şimdi sivrisinekleri beslemek ve onları enfekte etmek için kullanılacak.

Bu kanı bir zar besleyiciye ekleyeceğiz ve bu zar besleyici sivrisineklerin bulunduğu bir kabın üzerine yerleştirilecek ve sivrisineklerin yaklaşık 25 dakika boyunca bu kanla beslenmesine izin vereceğiz. Stabilize etmek için membran besleyiciye bir klips yerleştirdik. Temelde ağ üzerinde ağırlıklandırır ve şimdi kanı besleyiciye ekleyeceğiz.

Bazı durumlarda, bu deney karanlıkta yapıldığında daha iyi sonuç verebilir, çünkü doğal olarak sivrisinekler genellikle karanlıkta beslenir. Bu elbette sivrisinek kolonisinin nasıl şartlandırıldığına bağlıdır. Sivrisinekler şimdi yaklaşık 25 ila 30 dakika beslendi ve membran besleyiciyi çıkarabilir ve dekontaminasyon için güvenli bir kaba koyabiliriz.

Kan yerleştirildikten sonra, uygun olmayan sivrisinekler beslenenlerden uzaklaştırılmalıdır. Bunu yapmak için, kanla beslenen sivrisinekleri içeren küçük kapları beş ila 10 dakika boyunca soğuk odaya koyarak sivrisinekleri yere serdik. Gördüğümüz gibi, sivrisinekler zaten soğukta.

Kapağı açıyoruz ve sivrisinekleri bir buz kovası üzerinde tutulan küçük bir benzin kabına aktarıyoruz, böylece sivrisinekler baştan sona soğukta kalıyor ve kaçamıyorlar. Unutmayın, bunlar enfekte sivrisineklerdir, bu yüzden gevşemelerine izin vermemek için her türlü özen gösterilmelidir. Sivrisinekler soğuk odaya düştüklerinde, sivrisinekleri oda sıcaklığında tutulan normal iç odaya aktarırlar, ancak sivrisinekleri her zaman buz kovasında tutulan petro kabına koyarız, böylece her zaman aşağıda kalırlar.

Beslenen sivrisineklerin UNFI sivrisineklerinden nasıl çıkarılabileceğini görebilirsiniz. Beslenenlerin içinde kan var. Tamamen büyümüş durumdalar.

Bazıları kısmen kanla beslendi, bu yüzden tam olarak tıkanmadılar. Karınlarında küçük bir kan vardır, ancak diğerlerinin karınlarında çok fazla kan vardır. UNFI olanların karınlarında hiç kan yoktur ve bu nedenle Fed ile uygun olmayanları kolayca, kolayca ayırt edebilirsiniz.

Bu yüzden bu sivrisinekleri benzin kabından balmumu hattı karton bardaklarına aktaracağız. Bir sonraki adım, sivrisinekte dang virüsü enfeksiyonunu test etmektir. Sivrisinek orta bağırsağındaki virüs enfeksiyonunu test etmek istiyorsak, sivrisinekleri kan yemeğini aldıktan sonra yaklaşık yedinci günde incelemeliyiz.

Ve tükürük bezindeki virüs enfeksiyonunu test etmek istiyorsanız, kan beslemesinden yaklaşık 14 gün sonra sivrisinekleri incelemeliyiz, Jose şimdi size bağırsakları sivrisinekten nasıl ayıracağınızı gösterecek. Sivrisinekler şimdi buz üzerinde uyuşturuldu ve onları yaklaşık bir dakika boyunca% 70 etanol içinde bir inkübasyon yoluyla öldüreceğiz. Daha sonra, sivrisinekleri art arda iki su banyosuna aktarıyoruz.

Her biri bir dakika. Bu, etanolü sivrisineklerden uzaklaştırmak içindir. Şimdi PBS'deki sivrisinekleri mikroskop slaytları üzerinde inceleyeceğiz.

Bir jip zaman sivrisineğinden orta bağırsağı ayırmanın en iyi yolu, sivrisineği kanatlarının üzerine baş aşağı yerleştirmek ve karın kısmını bir forseps ile ve göğüs kısmını başka bir forseps ile tutmak ve ardından sivrisineği çekmektir. Şimdi Jose sivrisineği ayırıyor ve bağırsak, karın ile sivrisineğin torasik kısmı arasında görünecek. Şimdi bağırsak, sivrisineğin üst kısmında ortaya çıkan yarı saydam dokudur.

Şimdi diseke edilmiş bağırsağı bir hücre hattı ortamına aktaracağız ve virüs parçacıklarını bağırsaktan izole etmek için doku kültürü başlığına getireceğiz. Diseke edilen orta bağırsakları doku kültürü odasına getiriyoruz ve virüs partiküllerini serbest bırakmak için havaneli ile homojenize ediyoruz. Orta bağırsak homojenizasyonundan sonra, virüs partiküllerinin bir ila 100 seyreltilmesini sağlamak için homojenata ortam ekleriz.

Sonra bunu birden 10'a, birden 101'e 1000'e kadar seyreltmeye devam ediyoruz. 96 oyuklu plakada, 24 oyuklu bir plakada %80 co akıcılığına Alba picto hücre hattı hazırladık. Daha sonra hiatus alba picto hücrelerinden supnatantı çıkarırız ve bu hücrelere, her seyreltmedeki virüs partiküllerinin konsantrasyonunu belirlemek için seyreltilmiş virüs partiküllerini ekleriz.

Bu, virüsün enfeksiyon seviyesini belirlememizi sağlayacaktır. Sivrisinek orta bağırsağında, hücreler daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yavaşça çalkalanır. Daha sonra hücreleri 37 derece CO2 inkübatörde 45 dakika boyunca yerleştiriyoruz.

Daha sonra her bir oyuğa bir ml% 1 metil selüloz kaplama ekliyoruz ve plaka daha sonra beş gün boyunca 37 derece CO2 İnkübatörde tekrar inkübe ediliyor. Beş günlük inkübasyondan sonra, her oyuğa bir ml aseton metanol fiksatif ekliyoruz. Sonra plakayı dört santigrat derecede bir saat buzdolabında inkübe ediyoruz.

Daha sonra, fiksatifi çıkarırız ve her bir kuyuyu bir kez PBS ile yıkarız. Daha sonra,% 5'lik bir kan çözeltisi içinde anti dang birincil antikorunun bir ila 1000 oranında seyreltilmesini yapıyoruz. Daha sonra, bu antikor çözeltisinden 200 mikrolitre ekliyoruz.

Her birine, iyi Başını hareket ettir. Teşekkürler. Daha sonra, plakayı 37 santigrat derecede bir saat inkübe ediyoruz. Daha sonra hiperimmün sıvıyı çıkarırız ve her birini bir XPBS ile yıkarız.

Daha sonra, prosedürü ikincil bir antikor ile tamamen aynı şekilde tekrarlıyoruz. Protokole göre 20 ml substrat hazırlandı ve bir kaba ekliyoruz. Daha sonra her bir kuyucuğa 200 mikrolitre substrat ekliyoruz.

Daha sonra substratı çıkararak reaksiyonu durdururuz ve her kuyucuğa bir ml damıtılmış su ekleriz. Daha sonra plakadaki suyu atıyoruz ve tabağın kurumasına izin veriyoruz. Her renk noktası bir virüs plağını temsil eder ve bu plakları sayarak, homojenize ettiğimiz sivrisineğin orijinal orta bağırsağında bulunan virüs parçacıklarının sayısını tahmin edebiliriz.

Size aegypti sivrisineğinde dang virüsü enfeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğine dair prosedürü gösterdik. Bu protokol, sivrisinek hücre hattında virüs üretimini içerir. Virüs parçacıkları daha sonra hücre hattından saflaştırılır ve izole edilir ve insan tam kanı ile karıştırılır ve sivrisineklere verilir.

Virüs sivrisinekleri enfekte eder ve enfeksiyon kurulduktan sonra, sivrisineklerin orta bağırsak dokusunu nasıl izole edeceğinizi ve bu orta bağırsağın enfeksiyon seviyesini nasıl belirleyeceğinizi gösterdik. Temel olarak orta bağırsağı homojenize ediyoruz ve bu orta bağırsaktan virüs parçacıklarını serbest bırakmak için prosedürü kullanıyoruz. Daha sonra bu virüs parçacıklarını, orta bağırsağın enfeksiyon seviyesini, sivrisinek bağırsağını enfekte eden virüs parçacıklarının sayısını belirlemek için sivrisinek hücre hattını tekrar enfekte etmek için kullanıyoruz.