Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

Benim adım Shish ve Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu'nda Dr. George OU'nun laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Moleküler Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde, phis Gambi sivrisineklerinin nasıl yetiştirileceğini göstereceğim. Laboratuvarda, bunları genellikle 27 °C sıcaklıkta ve %80 nemde tutulan böcek odasında muhafaza ediyoruz.

Böcek odası, doğal koşulları taklit edebilmemiz için 12 saatlik bir gündüz-gece döngüsünde tutulmaktadır. Burası, burada bulunan temel bir tesis olan ve bu böceklerin yetiştirildiği böcek odasıdır. Gördüğünüz gibi, burada sivrisineklerin yumurta, larvaların farklı evreleri ve pupa gibi tüm farklı aşamalarının bulunduğu çeşitli tepsiler bulunmaktadır.

Bu tepsilerde, yaklaşık 11 veya 12 günlük larvalar bulunmaktadır; yetişkin sivrisinekleri topladığımız ve %10'luk sükroz çözeltisi ile beslediğimiz yer ise bu kafestir. Sivrisinek yetiştirmeye başlamak için, sivrisinekleri kanla beslememiz gerekir çünkü yumurta bırakabilmek için kanın proteinine ihtiyaç duyarlar. Dolayısıyla birinci gün, yetişkinlerin bir kafese toplandığı ve %10'luk sükroz ile beslendiği gündür.

Birinci gün sivrisineklerin kanla beslenmesi gerekir; bu nedenle yapay membran kanla besleme yöntemi uygulanır. Bu, sivrisineklerin membranla beslemesi için kullandığımız bir cam besleyicidir. Kanı, gördüğünüz küçük delikten içeri aktarıyoruz ve kan burada muhafaza ediliyor.

Alt tarafta, 37 °C'de tutulan bir su banyosuna bağlı iki nozul bulunmaktadır. Kanı 37 °C'de sıcak tutmak ve besleyiciyi besleme işlemi için hazırlamak amacıyla, küçük bir parça peril alırız. Bunu iki ucundan ve dört yanından gereriz, ardından cildi taklit eden ince bir membran tabakası oluşturmak için cam besleyicinin açık tarafına yerleştiririz.

Buna membran besleme denir. Bu, suyu 37 °C'de tutan ve aynı zamanda suyu cam besleyici üzerinden dolaştırarak kanın 37 °C'de sıcak kalmasını sağlayan sirkülasyonlu bir su banyosudur. Cam besleyiciyi küçük kapilerler aracılığıyla sirkülasyonlu su banyosuna bağlıyoruz ve su banyosunu çalıştırıyoruz; böylece su sirküle olur ve su ile kan iki ayrı bölmede oldukları için asla birbirine karışmaz.

Bu, yetişkin Phis Gambi sivrisineklerinin bulunduğu bir kafestir. Bu, sirkülasyon banyosuna bağlanan cam besleyicidir; kafesin üst kısmına bir kıskaç yerleştiririz ve 200 µL kan ekleriz. Kafeste hem erkek hem de dişi sivrisinekler bulunmaktadır.

Kanla beslenmek için sadece dişiler gelir. Beslenme işlemi yaklaşık 30 dakika boyunca sürer. Kanla beslenmeden iki gün sonra, yumurtlamaları için sivrisineklerin kafesine yumurta kapları yerleştiririz.

İşlem şu şekilde gerçekleştirilir. Küçük bir beher alınır ve kısmen distile su ile doldurulur; ardından bir parça kağıt alınarak ıslatılır, konik bir şekle getirilir ve distile su içeren beherin içine yerleştirilir; bu esnada kağıdın nemlendiğinden emin olunur. Daha sonra, herhangi bir sivrisineğin dışarı çıkmasına izin vermemeye dikkat ederek sivrisinek kafesi yavaşça açılır ve yumurta kapları içeri yerleştirilir.

Kapların kafese yerleştirilmesinden bir gün sonra, yani dördüncü günde, kaplar yavaşça kafesten çıkarılır. Bunlar, içinde bazı ölü sivrisineklerin de bulunduğu siyah renkli yumurtalardır. Yumurtalar hazır olduğunda, bunları plastik bir tepsiye yerleştirirsiniz.

Önce, plastik tepsi distile su ile doldurulur. Yumurtaların bulunduğu filtre kağıdı alınır ve dışarı çıkarılır. Ayrıca, öğütülmüş balık yemi olan bir tutam besin A eklenir ve tepsi rafa yerleştirilir.

Tepsiyi başlattığımız gün teraziye almalıyız ve burada hangi türlerin olduğunu belirlemeliyiz. Bu işlem, yumurtaları tepsiye yerleştirdiğinizden bir sonraki gün yapılır. Yani, bunlar bir günlüklerdir, ancak asıl protokol sivrisinek gününün beşinci günündedir.

Siyah olanlar, larvalara dönüşmek üzere olan yumurtalardır. Bunlar ise sivrisinek yemleridir. Sivrisinek yetiştirmek için genellikle üç farklı tür yem kullanırız.

Yem A aslında öğütülmüş balık yemidir ve bu yemi, sivrisinek kültürü başladığında, X evresindeyken ekleriz; her gün Purina marka kedi yemi olan iki tablet Yem C ekleriz. Sekiz veya dokuz gün sonra tepsinin suyunu değiştirip taze su veririz. Ve o sırada, Yem A yerine, öğütülmüş Yem C'den başka bir şey olmayan öğütülmüş kedi yemi olan bir tutam Yem B ekleriz ve ayrıca yumurtaların larvalara dönüştüğü aşamada iki tablet Yem C ekleriz.

Larvaların üç farklı evresi bulunmaktadır. Birinci evre, ikinci evre ve üçüncü evre. Bunlar, beş veya altı günlük larvaların bulunduğu tepsilerdir.

Bunlar, dokuz ila 10 günlük olan ve çok daha ileri bir evrede bulunan Ravi'lerdir. Bu süreçte su değiştirilmiş, taze su ve taze yem eklenmiştir. Bu tepside hem yetişkinler hem de ppe'ler bulunmaktadır.

Gördüğünüz gibi bunlar, sivrisinek ağlarının altında uçan yetişkinlerdir. Kenarda ise yetişkinlere dönüşecek olan koyu renkli pupaları görebilirsiniz. Yetişkinler oluştuklarında, şunun gibi bir kafaste toplanmaya hazır hale gelirler.

İç kısmında kağıt havlu astarı, %10'luk süper çözelti içeren küçük bir şişe ve sivrisinekler için besin kaynağı görevi görecek pamuklu bir sabun kutusu bulunmaktadır. Kapağı kapattık; bu aparat, tepsilerdeki erginleri toplamak için vakuma bağlanan aspiratördür. Aspiratörün bu kısmı buraya bağlanmıştır ve diğer uçta yer almaktadır.

Vakuma bağlandı. Yetişkinleri bu küçük kutuda toplayacağımız kafesi yerleştiriyoruz. Bu, sivrisinek tepsisinin içine yerleştirilecek uzun bir tüpe sahip olan aspiratörün başka bir parçasıdır.

Diğer uç kafese bağlanacaktır. Her şeyin sıkı olduğundan ve vakumun düzgün çalıştığından emin olmanız gerekir. Kapağı kapatıyoruz ve her şeyin sızdırmaz olduğundan emin oluyoruz.

Arka düzeneği yavaşça çalıştırın. Kurulum hazır olduğunda, ağ yapısını kapattığınızdan ve sivrisineklerin kaçmasına izin vermediğinizden emin olarak, bu uzun boruyu yavaşça sivrisinek tepsisinin içine yerleştirin. Gördüğünüz üzere, sivrisinekler küçük kafese toplanıyor.

Tüm yetişkinleri toplamak için pipeti yavaşça her yerde gezdirin. Artık neredeyse bitirdim. Tüm yetişkinler toplandı ve gördüğünüz üzere hepsi bu kafesin içinde.

Ardından vakumu yavaşça boşaltır ve toplama düzeneğini söküp çıkarırız. Bunlar, birkaç gün boyunca bu kafeste tutulacak olan yetişkin Ana Gambi sivrisinekleridir. %10 sükrozla beslenecekler ve yumurta dökme aşamasına gelindiğinde beslenmeleri için kan verilecektir.

Sivrisineklerin nasıl yetiştirileceğini size az önce gösterdim. Laboratuvar koşullarında sivrisinek yetiştirmenin önemli adımları, önce kan beslemesi yapmaktır. Ardından yumurta kaplarının yerleştirilmesi, yumurtaların takibi ve sonrasında larva, pupa ve ergin gibi farklı aşamalardan geçmeleridir.

Ve son olarak, yetişkinleri topluyoruz. Bu tekniğin önemi, sağlıklı sivrisineklere sahip olmak için doğal ortamdaki dış koşulları taklit etme zorunluluğumuzdur; ardından bunları Plasmodium ile enfekte ediyoruz ve temel amacı sıtmayı dünyadan tamamen yok etmek olan farklı sıtma çalışmaları gerçekleştiriyoruz.