Name: Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin Drosophila gastrula embriyolarından birincil hücre kültürü hazırlama yöntemini. RNAi gen fonksiyon analizi ve hücre görüntüleme için bu protokol araştırmacılara güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JB Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı Bursu DRG-1716-1702 tarafından desteklenmiştir. JZ NIH / NIGMS Bursu F32 GM082174-02 tarafından desteklenmiştir. NP Howard Hughes Tıp Enstitüsü&#39;nden bir araştırmacı.

1. Sinek kafesleri hazırlanması <ol><li> Drosophila (Oregon-R ya da herhangi bir genotip gibi yabani tip suşlar), 32-oz böcek bardak gibi uygun kaplarda büyütün. </li><li> Büyük embriyo toplama kafesleri Transfer yeni eclosed sinekler veya nüfus kafesleri uçmak. </li><li> ~ 25 bir sıcaklık ile bir odaya kafesleri Taşı ° C ve nem ~ 65% 12 saatlik ışık ve senkron embriyoların toplanmasını kolaylaştırmak için, 12 saat karanlık bir döngüsü. </li><li> Onlara pekmez plakalar üzerinde çizikler maya yapıştırın öldürdü beslenme kafeslerde sinekler koruyun. 2-3 günde bir kez pekmez levhalar (öldürüldü maya yapıştır ile) değiştirin d. </li></ol> 2. Senkron embriyo toplanması <ol><li> Birincil hücre hazırlık günü, 1-2 saat öncesi yatıyordu süre yapıştırın öldürüldü maya ile kaplı uçar wth taze plakaları beslenirler. </li><li> Sadece 12 saat karanlık döngüsü önce, az miktarda maya hamur çizgili taze pekmez plakaları ile ön yatıyordu plakaları değiştirin. Asenkron büyük embriyoları içeren öncesi yatıyordu toplanması, atın. </li><li> 1-2 saat bir süre için toplayın embriyolar </li><li> 5-6 saat boyunca 25, embriyo ve mağaza nispeten senkron nüfus içeren plakalar ° C çıkarın Embriyolar bu zamanda, ileri gastrula aşamada olacak. </li></ol> 3. Toplama ve embriyo yıkama <ol><li> Embriyoların altındaki en güzel örgü elek toplamak, böylece, ıslak bir fırça ile plakalar embriyoların gevşetin ve yığılmış elekler ılık musluk suyu ile iyice durulayın. Mümkün olduğu kadar çok maya ve sinek enkaz kaldırmak için bir kaç dakika durulayın. </li><li> İpucu embriyoların bir tarafında birikir elekler ve bir dechorionation sepet içine yavaşça elek onları yıkayın. </li><li> Embriyoların kurumasına izin vermeden doku kültürü kaputu alana taşıyın. </li></ol> 4. Embriyo hücrelerinin Homojenizasyon ve kaplama <ol><li> Sterilize ve embriyoların% 50 (hacim / hacim) 5-10 dakika çamaşır suyu çeker dechorionate. Sepet duvardan embriyoların% 70 (hacim / hacim) etanol ile durulayın. Alternatif olarak, etanol tedavi öncesi, distile su ile çamaşır suyu embriyolar kapalı yıkayın. Bu noktadan itibaren embriyolar steril şartlarda ve doku kültürü kaputu içinde ele alınmalıdır. </li><li> Otoklavlanmış distile su ile çamaşır suyu ve / veya etanol kaldırmak için embriyoların iyice durulayın. </li><li> Dechorionation adım sırasında, embriyoların miktarına göre oda sıcaklığında M3 orta uygun hacmi ile Dounce Homojenizatör doldurun. Embriyo ve medya hacmi arasındaki oranı 0.5 ml embriyolar üzerinde olmamalı: 40 ml medya (veya ~ 100-200 embriyolar / ml). </li><li> Batığın embriyoların M3 medya için yeterli miktarda steril bir beher durulanır embriyolar yerleştirin. Embriyolar 2-5 dakika bekletin edelim. </li><li> Dechorionation sepeti sökün ve Nitex örgü kuru steril kağıt havlu ile kurulayın. </li><li> Homojenizatör embriyolar steril bir fırça ile aktarın. </li><li> Tüpün alt ulaşmadan tüm embriyolar askıya alınır kadar gevşek bir havaneli kullanarak kısa vuruş ile hafifçe karıştırılır. Sonra kibarca ama kesin bir tavırla, tam sekiz vuruş ile homojenize. Aşağı yukarı doğru hareket eder ve havaneli bükmeyin. </li><li> 50 ml steril konik santrifüj tüpü içine dökme veya pipetleme ya Homojenat transfer ve tüp kap. </li><li> 40g, pelet oda sıcaklığında doku artıkları, büyük hücre kümeleri ve vitelline membranlar 10 dakika santrifüjleyin. Temiz bir tüp hücreleri ve yumurta sarısı içeren süpernatant aktarın ve 5 dakika süreyle santrifüj adımı tekrarlayın. </li><li> Hücreler dökülerek veya pelet, 360g oda sıcaklığında 10 dakika için temiz bir tüp ve spin pipetleme süpernatantı dikkatlice aktarın. Süpernatantı atın. 10 ml kültür ortamı hücre pelet (RNAi deneyler için serum orta) tekrar </li><li> Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için bir hemasitometre kullanarak canlı hücreler güvenin. Bu arada, pelet hücreleri 4.10 adımı tekrarlayın. </li><li> Istenen konsantrasyon hücreleri yeniden süspanse edin. Başlatmak için, bir dizi 1 ~ 5 x10 6 hücre / ml ve 1,7 - 2,5 x10 5 hücre / cm 2 plaka deneyin . </li></ol> 5. 384 plaka yetiştirilen hücreler için İlköğretim-hücre RNAi <ol><li> ~ 250 ng 384 plaka de ortalama bir final konsantrasyonda her kuyuya dsRNAs 5 ul koyun. </li><li> Çok kanallı pipet kullanın, 10 ml (1 ~ 4x106 hücre / ml) 384-plaka her yanı farklı bir dsRNA içeren bir serum serbest M3 orta başına birincil hücreler dağıtmak. Alternatif olarak, hücre konfokal görüntüleme için 8-iyi cam oda slaytlar üzerinde yetiştirilebilir. </li><li> 300g oda sıcaklığında 1 dakika süreyle plakaları santrifüjleyin. 25 serum orta Kültür hücreleri ° C 22 saat veya 18 ° C 1-2 d. </li><li> Her bir kuyunun 30 ml serum içeren kültür ortamı ekleyin. </li> 300g oda sıcaklığında 1 dakika süreyle plakaları santrifüjleyin. <li> ~ 7 gün 25 nemli bir ek 5 odası ve kültürü birincil hücreler ° C tabak koyun </li><li> Resim hücreleri ya canlı ya da immünofloresan boyama sonra. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: En uygun koşullarda, kültür hücreleri yuvarlak bir morfoloji sağlıklı görünecektir. Kültür küçük hücre artıkları ve ilk kaplama sonra 50 ~% 80 birleşmiş olacak. Bu hücreler, uzun bir süre için kültür sonra morfolojik değişikliklere uğrayacaktır. Genellikle tam 25 farklı kültür hücreleri için yaklaşık 5-8 gün sürer ° C İyi kalite primer kültürlerinde genellikle hücrelerin-faiz kültürü ne kadar iyi ayırt tarafından değerlendirilecektir. Örneğin, birincil kas hücreleri genellikle bir dal gibi morfoloji ve multinükleer myotubes myofibrils gibi bir dizi sarcomeres oluşan şerit haline. Tamamen farklılaşmış myotubes kültüründe genellikle kendiliğinden hareket eder. Buna karşılık, farklı birincil nöronların hücre gövdeleri ile kümeler oluştururlar ve akson kabloları ile diğer kümeler ile bağlantı. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Birincil hücre kültür kaplama sonra morfolojik değişikliklere uğrarlar Birincil hücreler (A) 384 plaka iyi sağ kaplama edildikten sonra parlak bir alan görüntü. Hücrelerin büyük çoğunluğu yuvarlak ve sağlam ve çok iyi ayrılmış. (B) Primer hücre kültürü parlak bir alan görüntü kaplama 20 saat sonra. İlköğretim hücreleri zaten bir şube gibi morfolojisi (uzun ok) kümeleri (büyük ok ucu) ve kaslar bu aşamada kabul edilebilir oluşturur. (C) primer kültür kaplama 5 gün sonra faz-kontrast görüntü. Kültür nöronal uzantıları (küçük oklar), nöron kümeleri (büyük ok başları) ve kasları (orta ölçekli ok), çok daha gelişmiş görünüyor. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. 384 plaka kültür dsRNAs ile tedavi birincil hücre örnekleri İlköğretim Dmef2-Gal4 taşıyan embriyolar, D42-Gal4 UAS-mito-GFP transgenlerin, hangi Dmef2 Gal4 ve kasları ve motor nöronlar mito-GFP D42-Gal4 sürücü ifadesi, sırasıyla hücreleri izole edildi. Hücreler lacZ (AC) veya şişirilmiş (eğer varsa) (DF) ya da hedef dsRNAs ile tedavi edildi. Birincil kas ve nöronların her ikisi de, GFP (A, C, D, F) tarafından görülebilir. Nöronal uzantıları beyaz oklar. Aktin (ok başları) Phalloidin boyama, kültür lacZ dsRNAs (B ve C) ile tedavi edilen bir şube gibi kas yapısı ortaya, ancak kültür yuvarlak kas morfoloji eğer tedavi dsRNAs (E ve F). Birleştirilen görüntülerin (C, F), kasları sarı lekeli, ama kırmızı negatif gösterir nöronlar ve onların uzantıları (beyaz oklar). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Insan vitronectin kaplı kapak cam slaytlar kültüre birincil kasların Konfokal mikrograflar İlköğretim kasları immunofluorescently anti-Drosophila Titin (KZ) (birleştirme kırmızı) ve aktin için Phalloidin (birleştirme yeşil) ile boyandı. Üst paneller, vahşi-tip kontrol kas ve alt olanlar sals (CG31374) kısaltılmış sarcomeres RNAi kas vardır.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

Drosophila hücrelerin primer kültürlerinin gelişim model, büyük ölçüde muhtemelen birincil hücre hazırlık sürecinde çeşitli değişkenlere bağlı olarak değişebilir . Her şeyden önce, yumurtlama için kullanılan uçar genç (eski bir hafta içinde) ve sağlıklı (viral ya da bakteriyel enfeksiyon ücretsiz). Bunlar işe yaramaz ve bu embriyoların elde edilen hücrelerin ayırt edemez ve sadece 1-2 gün hayatta olarak gübresiz veya enfekte embriyolar kaçınılmalıdır. İkincisi, homojenizasyon işlemi sırasında, çok fazla embriyo...

<table><tbody><tr><td>Shields ve Sang M3 besiyeri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından insülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Büyük embriyo toplama kafesleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>#25 ABD standart test eleği</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>#45 ABD standart test eleği</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>#120 ABD standart test eleği</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Dounce doku parçalayıcı, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Dounce doku parçalayıcı, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Dounce doku parçalayıcı, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 384 kuyucuklu plaka</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II bölmeli lamine cam</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

birincil hücre kültürleri drosophila gastrula embriyolar

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Burada Drosophila gastrula embriyolar ayrı hazırlanması ve kültür birincil hücreler için bir yöntem açıklanmaktadır. Kısacası, büyük bir miktarı, genç ve sağlıklı bir sinek embriyolar sahnelenen, toplanan sterilize ve sonra bir cam Homojenizatör kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine fiziksel olarak ayrışmış. Kültür plakaları veya kültür ortamı uygun bir yoğunlukta odasına slaytlar kaplama olduktan sonra, bu hücreler daha fazla kendi özel hücre belirteçleri ile tespit edilebilir çeşitli morfolojik farklı hücre tipleri, ayırt edebilirsiniz. Ayrıca, çift zincirli (ds) RNA&#39;lar gen demonte ortaya çıkarmak için bu hücrelerin tedavisi için şartlar mevcut. Drosophila primer hücrelerde Verimli RNAi dsRNA içeren kültür ortamında hücrelerin sadece banyo yapılır. Diğer moleküler, biyokimyasal, hücre görüntüleme analizleri ile birlikte, etkili RNAi pertürbasyon yürütmek için yeteneği, özellikle Drosophila birincil hücreler, farklılaşmış kas ve nöronal hücrelerin ilgili olanlar olarak cevaplandırılmak üzere çeşitli sorular sağlayacaktır.

Biz ayrı primer hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol<em&gt; Drosophil</em&gt; Embriyolar. Yeteneği, biyokimyasal, moleküler ve hücre görüntüleme yöntemleri ile birlikte, etkili RNAi pertürbasyon yürütmek için çeşitli sorular ele alınacak izin<em&gt; Drosophila</em&gt; Birincil hücreler.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Burada, Drosophila gastrula embriyolarından ayrıştırılmış primer hücrelerin hazırlanması ve kültüre edilmesi için bir yöntemi tanımlıyoruz. Kısaca, evrelendirilmiş miktarda...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila embriyolarından ayrıştırılan primer hücrelerin RNAi ve hücre görüntüleme analizleri için nasıl hazırlanacağını göstermektir. Bu işlem, öncelikle sinek kafeslerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hücreleri ayrıştırmak için senkronize embriyolar toplanır, yıkanır ve homojenize edilir.Ardından primer hücreler ekilir ve RNAi konstrüktları ile transfekte edilir. Sonuç olarak, RNAi'nin diferansiye olmuş primer hücreler üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar, immünofloresan mikroskopi yoluyla elde edilebilir. Benim adım Namo.Harvard Tıp Fakültesi Genetik Bölümü'nde profesör ve Overuse Tıp Enstitüsü'nde araştırmacıyım. Bugün ben, laboratuvar araştırmacısı Jonathan ve laboratuvarımızdaki eski bir uzman araştırmacı ile birlikte, fare embriyolarından primer hücreler üretme tekniğini sizlere tanıtacağız. Bu teknik, hücre ve gelişim biyolojisindeki birçok uygulama için önemlidir; özellikle Janu'nun birkaç yıl önce gösterdiği gibi, bu metodoloji primer kas hücrelerinde genom çapında CRISPR ekranlamaları için kullanılabilir.Bu tekniğin, yerleşik ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, primer hücre kültürünün organizmanın biyolojisini daha doğru yansıtmasıdır. Genellikle, bu yöntemi uygulayan bireyler zorluk yaşayacaktır çünkü birkaç adım sadece protokolü okuyarak kolayca öğrenilemez. Öldürülmüş maya macunu hazırlamak için önce granül canlı mayayı bir kahve öğütücü ile ince bir toz haline getirin, ardından bir beherin içine yerleştirip 20 dakikalık kuru siklus kullanarak otoklavlayın. Otoklavlama işleminin hemen ardından.Maya ile diş macunu kıvamında bir macun oluşturmak için yeterli miktarda steril sıcak su ekleyin. Drosophila embriyolarından ayrıştırılmış primer hücreleri hazırlamak için, Oregon R gibi bir yabani tip drosophila suşu besleyin ve yeni çıkan sinekleri geniş embriyo toplama kafeslerine veya sinek popülasyon kafeslerine aktarın. Ardından, senkronize embriyoların toplanmasını kolaylaştırmak için kafesleri yaklaşık 25 °C sıcaklık ve %65 nem oranına sahip, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsü olan bir odaya taşıyın ve sinekleri besleyin.Melas plakalarına ekilmiş maya ezmesi. Besin plakalarını iki ila üç gün boyunca günde bir kez değiştirin. Birincil hücre hazırlama gününde, sinekleri bir ila iki saatlik bir yumurtlama öncesi dönemi için taze plakalarla besleyin.12 saatlik karanlık döngünün hemen öncesinde, ön hazırlık plakalarını, minimal miktarda maya pastasıyla çizilmiş taze melas plakalarıyla değiştirin. Asenkron yaşlı embriyoları içeren ön hazırlık koleksiyonunu atın.Embriyoları bir ila iki saatlik bir süre boyunca toplayın. Nispeten senkronize embriyo popülasyonunu içeren plakaları çıkarın ve beş ila altı saat boyunca 25 °C'de saklayın. Bu aşamada, embriyolar toplama işlemi için gelişmiş gastro evresinde olacaktır.Beş ila altı saatlik inkübasyonun ardından, embriyoları plaklardan ayırmak için ıslak bir boya fırçası kullanın. Daha sonra embriyoları üst üste dizilmiş süzgeç setine yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla maya ve sinek kalıntısını uzaklaştırmak için iyice durulayın. Bu işlem sırasında embriyoların en alttaki süzgeçte toplanmasını sağlayın.Embriyoların bir tarafta toplanması için eleği eğin ve onları nazikçe elekten bir dekorasyon sepetine yıkayarak aktarın. Ardından, embriyoları hacimce %50'lik çamaşır suyuna daldırarak sterilize edin ve kaplayın. Embriyolar inkübe olurken beş ila 10 dakika boyunca ağartma işlemini sürdürün.Oda sıcaklığındaki ortamla homojenizatöre kadar doldurun. Embriyolar için 40 mL ortam başına 0,5 mL'den fazla olmayacak bir hacme ulaşmak için M üç orta derece ortamı ekleyin. Ardından, embriyoları sepetin duvarından hacimce %70 etanol ile durulayın.Çamaşır suyu ve/veya etanolü uzaklaştırmak için embriyoları otoklavda distile edilmiş su ile iyice durulayın. Ardından, durulanan embriyoları M3 ortamına daldırın. Steril bir beher içinde, embriyolar inkübe olurken iki ila beş dakika boyunca bekletin; bu sırada dekorasyon sepetini sökün ve NYX mesh'i steril kağıt havlularla kurulayın.Embriyolar M three ortamında bekletildikten sonra, steril bir boya fırçasıyla homojenizatöre aktarın; gevşek bir havan eli kullanarak kısa darbelerle nazikçe homojenize edin ve tüm embriyolar süspansiyon haline gelene kadar havan elini tüpün dibine kadar itmekten kaçının, ardından sekiz tam darbe ile nazik ama sıkı bir şekilde homojenize edin. Havan eli yukarı aşağı hareket ederken döndürmeyin. Homojenatı, dökerek veya pipetleme yoluyla steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve tüpün kapağını kapatın; doku kalıntılarını, büyük hücre kümelerini ve fetal membranları çöktürmek için oda sıcaklığında 40 g'de 10 dakika santrifüjleyin.Hücreleri ve vitellusu içeren süpernatantı temiz bir tüpe aktarın ve santrifüjleme adımını beş dakika boyunca tekrarlayın. Ardından, süpernatantı dökerek veya pipetleyerek dikkatlice temiz bir tüpe aktarın ve hücreleri çöktürmek için oda sıcaklığında 36 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın. Hücre peletini, RNAi deneyleri için 10 mililitre serumsuz kültür ortamında yeniden süspande edin.Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Ardından hücreleri tekrar 360 ×g kuvvetinde pelletleyin. Hücreleri mililitre başına 1 ila 5 × 10⁶ hücre konsantrasyonunda serumsuz M3 mediumu içinde yeniden süspanse edin ve her bir 384'lü plaka kuyucuğuna santimetrekare başına 1,7 ila 2,5 × 10⁵ hücre olacak şekilde ekin.Kuyu plakasına, kuyu başına yaklaşık 250 ng nihai konsantrasyonda beş µL çift zincirli RNA dağıtın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 384 kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna, serumsuz M3 ortamında bulunan mL başına 1 ile 4 × 10⁶ arası primer hücreden 10 µL dağıtın. Alternatif olarak hücreler, konfokal görüntüleme için sekiz kuyucuklu cam oda lamlarında kültüre edilebilir.Plakaları oda sıcaklığında, 300 Gs'de bir dakika boyunca santrifüj edin. Plakaları 25 °C'de 22 saat veya 18 °C'de bir ila iki gün bekletin. Her birine M üç kültür ortamı içeren 30 µL ek serum ekleyin.Plakları oda sıcaklığında, 300 Gs'de bir dakika boyunca santrifüj edin. Primer hücreleri, nemli bir inkübatörde 25 °C'de beş ila yedi gün daha inkübe edin. Son olarak, hücreleri canlı olarak veya immünofloresan boyama sonrası görüntüleyin.Optimal koşullar altında, hücreler ve kültür sağlıklı görünecektir. Yuvarlak bir morfolojiye sahip olan kültürde, az miktarda hücre kalıntısı bulunacak ve %50 ila %80 konfluensle kaplanmış olacaktır. İlk ekimden sonra hücreler morfolojik değişiklikler geçirecek ve 25 °C'de yaklaşık beş ila sekiz günlük kültürlemeden sonra tam olarak farklılaşacaktır; bu brightfield görüntüsü, ekimden hemen sonraki primer hücrelere bir örnek göstermektedir.Hücrelerin çoğunluğu, ekimden 20 saat sonra yuvarlak, sağlam ve birbirinden iyi ayrılmış durumdadır. Primer hücreler halihazırda kümeler oluşturmaya başlamıştır ve bu aşamada dal benzeri morfolojiye sahip kaslar fark edilebilir. Bu fazda, beş gün boyunca kültüre edilmiş primer hücrelerin kontrast görüntüsü; nöronal uzantılar, nöronal kümeler ve kaslar ile çok daha gelişmiş görünmektedir.Bu örneklerde, DMF2-GAL4, D42-GAL4 ve UAS-mitoGFP transgenlerini taşıyan embriyolardan primer hücreler izole edilmiştir; burada DMF2-GAL4 ve D42-GAL4 sırasıyla kaslarda ve motor nöronlarda mitoGFP ekspresyonunu yönlendirmektedir. Hücreler, LAC veya inflated hedeflerindeki çift zincirli RNA'lar ile işleme tabi tutulmuştur. Bu floresan görüntü, LAC'yi hedefleyen kontrol çift zincirli RNA'lar ile transfekte edilmiş kültürde, hem diferansiye olmuş primer kasları hem de GFP eksprese eden nöronları göstermektedir; beyaz ok nöronal uzantıları, ok başı ise dal benzeri bir kas yapısını göstermektedir. Diferansiye olmuş kaslar Phalloidin ile boyandığında, kasların yarısından fazlası dal benzeri bir yapı sergilerken, geri kalanı yuvarlaklaşmış bir morfoloji göstermektedir.Birleştirilmiş görüntüde kaslar sarıya, nöronal yapılar ise yeşile boyanmıştır. Bu floresan görüntü, inflated veya if genlerini hedefleyen çift sarmallı RNA'lar içeren kültürde, hem diferansiye olmuş primer kasları hem de GFP eksprese eden nöronları göstermektedir; phin boyaması ile görselleştirildiğinde beyaz ok nöronal uzantıları, ok başı ise kasları göstermektedir. Bazı dal benzeri kaslara sahip olan vahşi tip kontrollerin aksine, buradaki tüm kaslar yuvarlaklaşmıştır; bu birleştirilmiş görüntüde kaslar sarıya, nöronal yapılar ise yeşile boyanmıştır.Çift zincirli RNA'lar ile tedavi edilen bu kültürde yalnızca yuvarlatılmış bir kas morfolojisinin görülebildiğine dikkat edin. Nöronal uzantılar yabani tip kontrollerinkilere benzer görünse de, bu görüntüler kırmızı renkte anti drosophila titan ve yeşil renkte aktini işaretleyen Phin ile floresan boyama yapılmış primer kas hücrelerini göstermektedir. Bu paneller yabani tip kontrol kasını göstermekte olup, diğerleri kısalmış sarkomerlere sahip kaslar şeklinde gelişen RNAi tedavili kas hücrelerini temsil etmektedir.Bu prosedürü uygularken, deneyleriniz genelinde karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için protokolü tutarlı bir şekilde takip etmeyi hatırlamanız önemlidir. Teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki ila dört saat içinde tamamlanabilir.

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme Fura-2 kullanarak kalsiyum düzeyleri neurite akıbet ve görüntüleme göstermektedir.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Drosophila S2 hücreleri ve kültürlenmiş nöronların in vivo olarak motor tahrikli bir organel taşıma görüntüleme için büyük sistemlerdir. Burada, her iki hücre kültür tipleri için, görüntüleme ve taşıma analiz protokolleri ayrıntılı tarif etmektedir.

Kültürlü organel Ulaşım Drosophila Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Bu protokol, Drosophila melanogaster pupalarından elde edilen sağlam testislerin ve germ hattı kistlerinin diseksiyonunu ve kültivasyonunu tanımlar. Bu yöntem, spermatogenezin ex vivo mikroskobik olarak gözlemlenmesine izin verir. Ayrıca, inhibitörlerin pupa testislerde germ hücresi gelişiminin belirli aşamaları üzerindeki etkisinin farmakolojik bir analizini tarif ediyoruz.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

Burada, Drosophila gastrulasyonunun canlı görüntülerini yakalamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, erken gelişimde yer alan apikal daralmayı daha iyi anlamamızı ve doku yapısı modifikasyonu sırasında hücresel hareketleri yöneten mekanizmaları daha fazla analiz etmemizi sağladı.

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme Drosophila Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Drosophila hücre hatları temel ve Biyomedikal Araştırma önemli Kimyasalları vardır. Bu makalede çözdürme, subculturing ve araştırmacılar araştırma bu Kimyasalları kullanımı birleşmeyle yardımcı olmak için yaygın olarak kullanılan Drosophila hücre satırları dondurma protokolleri sağlar.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Yetişkin sineklerin sık sık taze gıda şişelerine aktarılmasına alternatif olarak Drosophila suşları için uzun süreli bir koruma yöntemi oldukça arzu edilir. Bu protokol, Drosophila primordial germ hücrelerinin dondurularak saklanmasını ve agametik konakçı embriyolara nakledilmeleri yoluyla suşun yeniden canlandırılmasını açıklar.

İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması

Öğrenin Drosophila gastrula embriyolarından birincil hücre kültürü hazırlama yöntemini. RNAi gen fonksiyon analizi ve hücre görüntüleme için bu protokol araştırmacılara güvenilir bir model sunar.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Daha fazla video keşfet