Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Bu deneyin genel amacı, iki ve üç boyutlu kültür ortamlarındaki hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılan cihazları mikro ölçekte üretmektir. Bu işlem, dikey olarak harekete geçirilen mikro direklerden oluşan bir dizi üretmek için çok katmanlı sandviç kalıplama ve istifleme tekniği kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, dikey hareketli mikro direk dizisi, bir kültür filmini germek için modifiye edilir ve böylece film üzerinde kültüre edilen hücrelere iyi kontrollü gerinmeler uygulanır.

Alternatif olarak, hücrelere mekanik stimülasyon uygulamak amacıyla mikro desenli biyomalzeme yapılarını sıkıştırmak için dizi modifiye edilebilir. Üç boyutlu hidrojellerden oluşan bir dizide kültüre edilen hücrelerde, floresan referans işaretçilerinin görüntü analizine dayanarak, dizi boyunca bir dizi iki boyutlu eko biaksiyel ve üç boyutlu kompresyon gerinimlerinin eş zamanlı uygulandığını gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Makine ve Endüstri Mühendisliği Bölümü ile Biyomalzemeler ve Biyomedikal Mühendisliği Enstitüsü'ndeki Craig Simmons ve U Sun laboratuvarlarından Chris Mariahs.

Bugün size, hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılan mikro cihazların üretimine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, hücrelerin in vitro kültürlerde çeşitli mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiğini incelemek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım.

Sandviç kalıp üretim süreci, kürlenmemiş polidimetilsiloksan veya PDMS'in bulunduğu bir SU-8 master üzerine şeffaf bir asetat kağıdı yerleştirilmesini içerir. Sandviç yapı, köpük cam ve metalden oluşan bir yığının içine yerleştirilir ve basınç altında bir fırında kürlenir. Son olarak, yığın sökülür ve desenli PDMS katmanı korunarak asetat kağıdı soyulur.

Bu işleme başlamak için PDMS, monomer ve çapraz bağlayıcıyı iyice karıştırın. Standart 10'a bir oranında, üç mililitre kürlenmemiş PDMS karışımını daha önceden hazırlanmış bir SU eight kalıbının üzerine dökün ve polimeri bir vakum odasında gaz gidermeye tabi tutun. Ardından, köpük pedi ve SU eight kalıbını bir pleksiglas taban plakası üzerine yerleştirin.

Hava kabarcığı kalmadığından emin olarak, bir inkjet şeffaf filminin pürüzsüz tarafını kürlenmemiş PDMS üzerine dikkatlice indirin. Ardından, ikinci köpük pedin altında kalan şeffaf filmin üzerine Silolize edilmiş bir cam lam ve üstüne pleksiglas bir üst plaka yerleştirin. Bu sandviç yapıyı bir C klempi kullanarak birbirine sabitleyin.

PDMS sandviçi bir fırında 80 °C'de en az dört saat boyunca kürleyin. Kürleme işleminin ardından sandviçi fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. Soğuma tamamlandığında, klempi çıkarın ve sandviçi sökün.

Şeffaf folyoyu, patentli PDMS filmi üzerinde tutarak SU eight master'dan dikkatlice soyun. Fazla PDMS'yi temizlemek için desen filminin kenarlarını kesin; desen katmanlarını, kullanılmaya hazır olana kadar tozsuz bir ortamda saklayın. Bu protokolün bir sonraki bölümü, dikey olarak hareketlendirilen mikro imalatlı bir post dizisinin oluşturulmasını içermektedir.

Mikro sütun dizisini oluşturmak için çok katmanlı bir üretim süreci gereklidir. En alttaki desenli PDMS katmanı, sandviç kalıp üretimi ile hazırlanır. Bu deneylerde, çapları 600 ile 1, 200 mikron arasında değişen dairesel desenler kullanılmıştır.

PDMS tabakasını temiz bir lam üzerine aktarmak için, PDMS ve cam yüzeyleri oksijen plazması ile işlemek amacıyla bir Corona deşarj ünitesi kullanın. Ardından iki yüzeyi birbirine temas ettirin. Yapıştırma işlemini tamamlamak için yığına 80 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerinde 10 dakika boyunca bekletin.

Şeffaf katmanı soyun ve atın. Bu işlem, desenli PDMS filmin sert bir alt tabakadan asla ayrılmamasını sağlayarak münferit katmanların büzülmesini önler. İkinci sandviç kalıplama katmanı, istenen diyafram ve sütun yapısının negatif bir replika kalıbı olarak oluşturulur.

Bu demonstrasyonda, bu katmanı oluşturmak için 500 mikron çapında dairesel direkler kullanılmıştır. İlk olarak, negatif replika kalıbı çift taraflı bant kullanarak bir lam üzerine geçici olarak sabitleyin ve vakumlu desikatörde silolanmış, kürlenmemiş PDMS'i sandviç kalıp katmanına depozit edin. Gaz giderme işlemini gerçekleştirin ve dakikada 1000 devirde 45 saniye boyunca spin kaplama yaparak 60 mikron kalınlığında bir aktüasyon diyaframı elde edin; spin kaplanmış PDMS katmanını 80 degrees Celsius'da yaklaşık 20 dakika boyunca veya PDMS yapışkan hale gelene ancak dokunulduğunda kalıcı olarak deforme olmayana kadar kısmen kürleyin. Cam lamı ve çift taraflı bandı kısmen kürlenmiş PDMS katmanından çıkarın ve şeffaf filmi bir çift cam taşıma lamına sabitleyip plazma işlemine tabi tutun.

Kısmen kürlenmiş PDMS'ye işlem uygulayın, ardından PDMS'yi ters çevirip özel yapım bir hizalayıcıya yerleştirin. Hizalayıcı, bir mikro manipülatöre monte edilmiş bir vakum tutucudan oluşur. Daha sonra ilk PDMS katmanına plazma işlemi uygulayın ve ardından bunu vakum tutucunun altındaki döner tablaya yerleştirin.

İki katman arasındaki hizalamayı 12 kat büyütmeli bir avatar makine görme sistemi ile gözlemleyin. Manipülatörü kullanarak katmanları hizalayın ve dikkatlice birbirine temas ettirin. Katmanların birbirine yapışması için bir parmakla hafifçe baskı uygulayın.

Ardından sandviçi hizalayıcıdan çıkarın. Cam taşıma lamlarını çıkarın ve katmanların birbirleriyle tam temas ettiğinden emin olun. 80 °C'deki bir fırında 30 dakika daha kürleme yapın.

30 dakika sonra, şeffaf ve silize replika PDMS kalıp cihazdan soyulup atılabilir. Daha sonra cihaz, deforme olan iki boyutlu bir substrat üzerinde kültüre edilen hücrelerle deneyler yürütmek amacıyla 80 °C'de en az dört saat boyunca tamamen kürlenir. Mikro aktüatör dizisi, cihaza üçüncü bir PDMS tabakasının bağlanmasıyla modifiye edilir.

Üçüncü PDMS katmanı iki katmanlı bir yapıdan oluşur. Alttaki daire, tahrik edilen mikro sütunların altındaki tahrik boşluğunun boyutuyla uyumludur. Üstteki dairenin çapı, yükleme sütunlarının çapından 100 mikron daha büyüktür.

Bu özellikleri bir bağlantı alanına bağlayan 200 mikron genişliğindeki bir mikro kanal, yükleme direklerini ve kültür filmini yağlamak için kullanılacaktır. Cihazı 2D kültür için modifiye etmek amacıyla, önce yazılı protokolde açıklandığı şekilde konnektörleri imal edin ve cihaza bağlayın. Ardından, bir şeffaf levhanın düz tarafına 10 ila 15 mikron kalınlığında bir PDMS tabakası spin-coat ile kaplayıp kürleyin.

İnce PDMS film 80 °C'de en az dört saat boyunca bekletilir. Bir sonraki adım, aktüatörlere vakum uygulamak ve PDMS tabakasını cihaza yapıştırmaktır. Bunu gerçekleştirmek için.

İlk olarak, aktüatörlere düşük seviyeli vakum uygulayarak plazma işlemine tabi tutulmuş ve bağlanmış direk dizisini indirin. Yazılı protokolde açıklandığı üzere, spin kaplama yöntemiyle PDMS film aktüatörlü mikro cihaza uygulandığında, direkler ve kültür filmi kısa bir süre hidrofilik kalacaktır. Ardından, yağlayıcı şırıngayı cihaza bağlayın ve yağlama kanallarını %90 gliserol içeren deiyonize su çözeltisiyle doldurun.

Bu formülasyon, yağlamanın yanı sıra PDMS'in hidrofilikliğini süresiz olarak koruyarak sürtünme katsayılarını düşürür. Cihazı 40 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plakaya yerleştirin ve kanala yağlayıcı enjekte etmeye devam ederek küçük bir basınç artışı oluşturun. Birkaç dakika sonra hava kabarcıkları PDMS boyunca yayılacak ve tüm yüzeyler yağlanmış olacaktır.

Son adımda, bir skalpel kullanarak destek sütunlarını serbest bırakan negatif basıncı kaldırın. İnce PDMS filminin etrafından kesin. Şeffaf destek katmanını, cihazın plazma bağımdan dikkatlice soyun.

Cihaz kültür alanı etrafına elle kesilmiş bir PDMS conta. Cihazı beş dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek sterilize edin, ardından bir biyolojik güvenlik kabininde germisidal UV ışığı altında 45 dakika boyunca işlem yapın. Yüzeyi plazma ile işlemden geçirin ve 100 µg/mL kolajen ile dört °C'de gece boyunca inkübe edin.

Gece boyu inkübasyonun ardından, cihazı steril fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve santimetrekare başına 10 ila 15.000 hücre olacak şekilde hücre ekimi yapın. Standart hücre kültürü protokollerini takip ederek, mikro aktüatör dizisi, üç boyutlu foto-desenli hidrojel konstrüktlarda kültüre edilmiş hücreler için deneyler yürütmek amacıyla modifiye edilebilir. İlk olarak, çok katmanlı PDMS tabanlı bir platform hazırlanır.

Taban platformu metil ile kaplandıktan sonra, ilgili bir cam lam örtü hidrojel öncü çözeltisi enjekte edilir. Ardından, fotopolimerize edilebilir bir biyomalzeme dizi üzerine mikro desenlerle işlenir ve geri kalan öncü çözelti yıkanarak uzaklaştırılır. Dikey olarak hareket ettirilen yükleme direklerinden oluşan dizi, daha sonra üç boyutlu biyomalzemelerde kültüre edilmiş hücrelere basılı mekanik kuvvetler uygulamak için kullanılabilir; direklerin etrafındaki alanlar scotch bant parçalarıyla maskelenerek cihaz, bir PDS 2010 lab COTER two sisteminde paraline C ile kaplanır.

Bu işlem, biyomalzeme sistemi için polimerizasyon kinetiğini iyileştirecektir. Kaplama tamamlandıktan sonra, cihazı kaplama sisteminden çıkarın ve scotch bandını soyarak sütunların üzerinde konformal bir paraline C tabakası bırakın. Ardından, %2 hacimce hacimce trimetoksipropil metakrilat içeren %95 etanol çözeltisine iki dakika boyunca daldırarak ACRL cam lamelini metilleyin.

Lameli durulayın. %100 ethanol ile yıkayın ve ardından yüzeyde metakrilat grupları bırakacak şekilde 100 °C'de fırınlayın. 200 µm kalınlığında bir PDMS ara katman dökün.

Bir Petri kabını filmle kaplayın ve filmi küçük bölümlere ayırın. Bu küçük bölümlerden dördünü, meac ilgili lamelin kenarlarına plazma ile bağlayın. Ardından, Lene C kaplı kısımları örten cihazın PDMS alanlarına boşlukları plazma ile bağlayın.

Son olarak, cihazı %70 etanol ile yıkayarak sterilize edin ve bir biyolojik güvenlik kabininde 45 dakika boyunca germisidle veya UV ışığına maruz bırakın. Hücre yüklü PEG hidrojellerini cihazlar içerisinde fotolitografik olarak desenlemek için; öncü madde ve foto başlatıcı çözeltilerini yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın ve ağırlık/hacimce %0,4 konsantrasyonda bir foto başlatıcı çözeltisi elde etmek için bunları iyice karıştırın.

Karışımı, sterilizasyon sağlamak ve partikülleri uzaklaştırmak için 0.45 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün, hücre kültürlerini tripsinize edin ve kültür ortamında, istenen son nokta hücre konsantrasyonunun iki katı yoğunlukta bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, hücre süspansiyonu ile filtrelenmiş hidrojel öncül foto başlatıcı çözeltisini bire bir oranda karıştırın. Çözeltiyi, uzun bir 25 gauge iğne kullanarak mikro cihaza enjekte edin.

Cihazda hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Basılı bir şeffaf maskeyi, cihaz yüzeyindeki hizalama işaretlerine göre hizalayın. Cihaz yüzeyinde 17.5 milliwatt per square centimeter değerinde, 365 nanometer dalga boyunda bir UV dozu sağlayacak bir UV aydınlatma sistemi kurun.

Aydınlatma sonrası hidrojeli maske üzerinden 195 saniye boyunca ışınlayın. Polimerize olmamış hidrojel öncül çözeltisini PBS ile yıkayarak uzaklaştırın ve PBS'yi kültür medyasıyla değiştirip hidrojel yapıları sıkıştırmak için yükleme direklerini çalıştırın. Burada, 2D mekanostimülatif kültür için tamamlanmış bir örnek cihaz gösterilmiştir.

Tahrik basıncı iletim kanallarını işaretlemek için kırmızı boya, yağlama kanallarının gerinim karakterizasyonunu işaretlemek için ise mavi boya kullanılır. Substratlar üzerindeki floresan boncuk hareketleri takip edilerek uygulanan gerinim alanlarının belirlenmesi için deneyler gerçekleştirilebilir. Kırmızı noktalar boncukların deforme olmamış konumlarını, yeşil noktalar ise deforme olmuş konumlarını temsil eder.

Yeşil boyanın aktüasyon basınç kanallarını işaretlemek için kullanıldığı, üç boyutlu sıkıştırma deneyleri için bir örnek düzenek burada görülebilir. Mikro post dizisinin üstten görünümü, postların üzerinde desenlenmiş hidrojel yapıyı ve hidrojel yapı içindeki floresan boncukların post yanlarından yeniden yapılandırılmış görüntülerini ortaya koymaktadır. Dinlenme hali ve 55 kilo pascal aktüasyon basınçları altındaki görüntüler, üç boyutlu bir kültür sistemindeki gerinim karakterizasyon sürecini göstermektedir.

Böylece, iki veya üç boyutlu kültür sistemlerindeki hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılan cihazların nasıl üretileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, cihazlarınızı mümkün olduğunca temiz ve tozsuz tutmaya dikkat etmeniz ve özellikle hizalama adımlarında sabırlı olmanız önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.