Name: Antijen Özgül In Vivo Killing Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin farelerde CD8+ T hücrelerinin in vivo sitotoksik aktivitesini CFSE etiketleme ve akış sitometrisi ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol, antijen-spesifik hücre öldürme kapasitesini nicel olarak ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bianca MOTHE Carla Oseroff ve Marie-France DelGuercio immünolojik testleri ve fare kullanımı için beni tanıştırdığı için teşekkür etmek istiyorum. GA Splitter laboratuarda çalışma NIH hibe 1-RO1-AI-073.558, GLRCE hibe 1-U54-AI-057.153, BARD ABD-3829-06 tarafından finanse edilmektedir.

1. Hedef Özel Efektör CTL'lerin Bağışıklama ortaya çıkartılması (Gün 0) <ol><li> Hedef sistemi: başlamadan önce, belirli bir efektör üzerine karar verebilir. Klasik bir in vivo CTL tahlil Bu örnekte, spesifik CD8 + T hücreleri ortaya çıkarmak için saflaştırılmış bir peptid bağışıklama kullanabilirsiniz. Hedef sistemi: Aynı peptid singeneik hedef hücreleri belirli bir efektör yaratarak darbe olacaktır. Alternatif olarak, özel etkileyiciler ve hedefleri elde etmek için tüm patojen veya protein kullanmayı tercih edebilir. </li><li> Enjeksiyonları kısırlık sağlamak için çalışma yüzeyinin bir biyogüvenlik kaput içinde dekontamine. İlk 50 mg, 2 mL tüp içinde yer alan PBS / fare 100 mcL% 10 DMSO peptit saflaştırılmış koyarak peptid bağışıklama hazırlayın. Daha sonra, karıştırma için 1 mm boncuklar ile 0,2 mL işareti ekleyin ve çok soğuk Eksik Freund adjuvan bir eşit miktarda. Bu açıdan bakıldığında, enjeksiyon kadar buz üzerinde immünojen tutmak. Parafilm ile güvenli kapak. </li><li> Derhal karıştırıldıktan sonra buz üzerinde emülsiyon yerleştirerek, 3 dakika boyunca emülsiyon karıştırmak için maksimum RPM'ler ayarlanmış bir boncuk çırpıcı kullanın. Emülsiyon kıvamda mayonez benzer olmalıdır. Emülsiyon 4 oturup ° C gecede herhangi bir ayrılık olduğunu kaydetti zaman izin verir (bir hafta), daha fazla karıştırma. Sağlayın </li><li> Herhangi bir boncuk yukarı çekmeyin dikkatli olmak emülsiyon çekmek için 1 ml şırınga ve 20 veya 20.5 iğne kullanın (boncuklar, iğne, ölçü daha büyük olabilir, ama yine de farkında olmak gerekir). </li><li> Subkutan enjeksiyon için kuyruk dibinde Güvenli fare. Biz, güvenli bir şekilde modifiye edilmiş bir plastik 50 ml konik tüp kullanmak ve yavaşça enjeksiyon için fare hareketsiz. 0,2 ml emülsiyon fare ile enjekte edilir. </li></ol> 2. Hasat Hedef Hücreler (Gün 8) <ol><li> Hedef hücreleri için saf singeneik fareler gerekecektir. AAALAC standartlara göre saf fareler Euthanize. </li><li> Fare, fare saç veya diğer harici kirleticiler kontaminasyon riskini en aza indirmek için% 70 Etanol püskürtülerek dezenfekte edin. </li><li> Diseksiyon makas kullanarak farenin sol tarafında deri yoluyla küçük snip olun. Periton kesesi ve iç organlarda ortaya çıkarmak için flep üzerinden çekin. </li><li> Periton yoluyla Snip, dikkatli olmanın temel organlarının herhangi bir taviz vermemek. Dalak, yüzeye yakın ve renkli karaciğer (koyu kırmızı) 'e benzer ama daha küçük ve şekil olarak daha barbunya. Enfekte fareler genellikle enfekte olmamış kontrollere göre özellikle büyük dalak göstermektedir. </li><li> Şekilde maksimum hücre sayıları kurtarmak için çoklu parçalar halinde dalak kırmak için nazik olmaya özen, dalak dikkatlice dışarı çekin. Hemen buz üzerinde hazırlanmış medya 10 mL içeren 15 ml konik dalak yerleştirin. Kalan fare ile devam edin. </li><li> Cam bir doku değirmeni içine 15 ml konik tüp (medya ve dalak) içeriğini dökün. Üst kol gücü bol kullanarak dalak Grind. Tüm doku rengini kaybetti bağ dokusu hücreleri kurtarıldı olduğunu varsayabiliriz. </li><li> 70 mikron hücre filtresi aracılığıyla değirmeni içeriği 50 ml konik bir tüp içine dökün. Değirmeni taze medya ile durulayın ve bir hücre süzgeç vasıtasıyla dökün. </li><li> Santrifüj 4 ° C, 7 dakika için 1300 RPM. Süpernatant kapalı dökün. </li><li> 10 mL reaktif ve 7 dakika 37 ° hazırlanan parçalama inkübe süspanse edin. </li><li> 50 mL kadar taze medya ve santrifüj, yukarıdaki gibi aynı ekleyin. </li><li> 50 mL taze medya ve santrifüj, yukarıdaki gibi aynı (yıkama adım) süspanse edin. * Not: Şu anda saf bir hedef hücre popülasyonunun transferi için alıcı farelere isteniyorsa, belirli bir hücre tipi için bir manyetik hücre ayırma (yani makrofajlar) gerçekleştirebilirsiniz. Ayrıca, şu anda hücre öldürme tedavisinin etkilerini araştırmak için deneysel bir tedavi kültürü haline getirebilir. </li><li> 96 iyi yuvarlak alt doku kültürü tedavi plaka 100μL x 10 7 de ortalama hücreleri ve plaka 1 güvenin. * Bu hücre / iyi bir yüksek konsantrasyon, ancak hızlı bir tahlil, çünkü biz bu konsantrasyonda hücre canlılığı kaybı gördük. </li></ol> 3. Hedef Hücre Tedavi ve Etiketleme <ol><li> Darbe uygun hücreleri ve patojen spesifik peptid veya alakasız peptid kontrolü ile çoğaltır: 1 mcg / ml peptid ekleyin. 1.5 saat 4 ° C'de inkübe edin. Son 30 dakika 37 ° C inkübatör taşıyın. Bu süre zarfında KAKE reaktif hazırlamak. </li><li> KAKE üretici özelliklerine göre hazırlayın ve 0.5 ile 25 mcM arasında bir çalışma konsantrasyonu sulandırmak. "Düşük" konsantrasyon "yüksek" konsantrasyon KAKE daha düşük 10x olun. Örneğin, [az] 10 mL PBS 0.5 mcL KAKE ekleyin ve [yüksek], 10 mL PBS 5 mcL KAKE eklemek. Sıcak hazırlanan KAKE 37 ° C etiketleme önce. </li><li> Kuvöz ve p hücreleri plaka çıkarınellet, oda sıcaklığı, 7 dakika için 1300 RPM yüksek hızda santrifüj. Süpernatant kaldırmak Flick. </li><li> [Düşük] veya ilgili kuyulara uygun reaktif 200 mcL ekleme ve 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° [yüksek] KAKE C ya da yeniden süspanse hücreleri </li><li> Oda sıcaklığında, 7 dakika için 1300 RPM, kuvöz ve tekrar pelet hücreleri plaka çıkarın. Süpernatant kaldırmak Flick. </li><li> 200 mcL / iyi ısıtılmış taze medya ve 30 dakika boyunca inkübe yeniden süspanse hücreleri 37 ° C </li><li> Oda sıcaklığında, 7 dakika için 1300 RPM, kuvöz ve pelet hücreleri plaka çıkarın. Süpernatant kaldırmak Flick. </li><li> 100 mcL / iyi PBS içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> Evlatlık transferi için, bir de [az] biri etiketli hücreleri [yüksek] fare başına düşen hücreler etiketli. Enjeksiyon sonuçlanan 0,2 mL% 50 belirli hedefleri ve% 50 ilgisiz hücreleri olmalıdır. </li><li> (Bakınız Şekil 1), veri analizi sırasında ve akış sitometresinde çalışan olmayan transfer kontrolleri olarak hareket etmek bazı etiketli hücreler bir kenara bırakarak unutmayın. </li></ol> 4. Evlatlık transferi <ol><li> AAALAC standartlarına göre önceden peptid aşı fareler anestezi (part # 1 Bu protokolün). </li><li> 0,2 mL alıcı farelere retroorbital yolla etiketli hedef hücreleri enjekte edilir. </li><li> Alıcı fareler euthanizing 6 saat önce ya da diğer önceden belirlenmiş en uygun zamanı bekleyin. </li></ol> 5. Hasat Etiketli Hücreler * Not: 5.1 5.11 üzerinden 2.11 üzerinden 2.1 adımları aynı Adımlar <ol start="12"><li> 96 yuvarlak alt doku kültürü tedavi plaka 100 mcL x 10 6 sıra ortalama 1 hücreleri ve plaka dışarı güvenin. </li><li> Tüm kuyuların% 1 paraformaldehid nihai konsantrasyonu 100 mcL% 2 paraformaldehid ekleyerek kurtarıldı ve non-transfer hücreler sabitleyin. </li></ol> 6. Akım Sitometri ve Veri Analizi <ol><li> Bir akış sitometresinde örnekleri çalıştırın ve verileri analiz. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Ortaya çıkan histogram azalan epitop özel zirve hücre belirli bir öldürme (Şekil 1) bir göstergesi. Hücre özel lizis gerçek değerini belirlemek için aşağıdaki denklemler (Tablo 1 uygulanan) kullanın: Oranı = Alakasız yüzdesi: epitopu Özel Yüzde ([düşük] zirve: [yüksek] pik), Yüzde Özel Lizis = [1 - (Sigara transfer kontrolü oranı / Deneysel oranı)] x 100 <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. BALB / c fare dalak kurtarıldı. Numaraları KAKE profili yüksek ya da düşük KAKE fenotipi hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. A) kontrol Sigara transfer. [Düşük] KAKE doruklarına [yüksek] KAKE doruklarına ilgisiz peptit ile darbeli hedefleri temsil ederken, epitop belirli hedef hücreleri temsil eder. B) KAKE etiketli hücreler PBS aşı alıcı fare (Kontrol) kurtarıldı. C) iki farklı peptid özel alıcı fareler kurtarıldı KAKE etiketli hücreleri, azalan epitop özel doruklarına unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Farelerin her grup, PBS, Peptid A ve Peptid B. gösterilen analiz verileri grafiksel gösterimi üç veri noktaları <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> KAKE YÜKSEK% epitop Pulsed </td><td> Alakasız KAKE DÜŞÜK% </td><td> Oranı Düşük Yüksek </td><td> Yüzde epitop Özel Killing </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 42,8 </td><td> 57,2 </td><td> 1,34 </td><td> 16,97 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 43,1 </td><td> 56,9 </td><td> 1,32 </td><td> 15,94 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 44,3 </td><td> 55,7 </td><td> 1,26 </td><td> 11,74 </td></tr><tr><td> Peptid A </td><td> 39,7 </td><td> 60,3 </td><td> 1,52 </td><td> 32,56 </td></tr><tr><td> Peptid A </td><td> 38,6 </td><td> 61,4 </td><td> 1,59 </td><td> 35,61 </td></tr><tr><td> Peptid A </td><td> 40,6 </td><td> 59,4 </td><td> 1,46 </td><td> 29,99 </td></tr><tr><td> Peptid B </td><td> 38,7 </td><td> 61,3 </td><td> 1,58 </td><td> 24,68 </td></tr><tr><td> Peptid B </td><td> 38,5 </td><td> 61,5 </td><td> 1,60 </td><td> 25,32 </td></tr><tr><td> Peptid B </td><td> 39,3 </td><td> 60,7 </td><td> 1,54 </td><td> 22,76 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS NT Control </td><td> 47,4 </td><td> 52,6 </td> 1,11 <td></td></tr><tr><td> Pep bir NT Kontrol </td><td> 49,4 </td><td> 50,6 </td><td> 1,02 </td><td></td></tr><tr><td> Pep B NT Kontrol </td><td> 45,6 </td><td> 54,4 </td><td> 1,19 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Temsilcisi veri analizi. "NT" olmayan aktarılır.

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti. Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

KAKE döl 10,11 arasında nispeten eşit böler, çünkü bu testte, klonal genişleme de dahil olmak üzere hücrelerin proliferatif kapasitesi araştırmak için değiştirilebilir. Örneğin tetramers ve biyoparlaklık 13, KAKE etiketleme ile kombine edilebilir hipoteze göre daha uygun olabilir yöntemleri diğer hücre izleme, var olmasına rağmen, hücre göçü 6,12 araştırmak için KAKE etiketleme kullanmak da mümkün. PE de işe yaramayabilir ise bir yüzey işaretleyici için eş-le...

<table><tbody><tr><td>1 mm cam boncuklar</td><td>Biospec Products</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu plaka</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Adjulite Eksik Freund&amp;rsquo;s Adjuvanı</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>FC 500 Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kontes cam doku öğütücü</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>İğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PharmLyse lizleme reaktifi</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFSE Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

antijen Özgül in vivo</emkake etiketli hedef hücreler> killing testi

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (KAKE) kolay ve hızlı bir şekilde in vivo soruşturma ilgi bir hücre popülasyonu etiket kullanılabilir. Bu etiketleme klasik çoğalması ve göç çalışması için kullanılır olmuştur. Burada sunulan yöntem, epitop KAKE etiketli hedef hücreleri 4-6 hayatta kalma ve öldürme bakmak için evlatlık transferinden sonra, zaman çizelgesi kısaltılmış var. Miktarları yanıltıcı olabilir gibi spesifik CD8 + T hücre klonu öldürme seviyesi, kalite yanıt gösterebilir. CD8 + T hücreleri, sitokin üretimi ve öldürme 7,8 düşüş zaman içinde işlevsel olarak tükenmiş olabilir Özgül. Ayrıca, belirli CD8 + T hücre klonlar TCR özgüllükleri 9 farklı yanı sıra diğerleri gibi öldürmek olmayabilir. Etkili Hücre aracılı bağışıklık (CMI), antijenler, T hücreleri yanıt yeterli sayıda sadece üreten tespit değil, aynı zamanda işlevsel olarak sağlam bir yanıt T hücreleri olmalıdır. Burada iki peptid BALB / c farelerde spesifik T hücre klonları yüzde hücre özel öldürme değerlendirir.

Birçok enfeksiyonları güçlü bir CTL yanıtı ortaya çıkarmak, fakat bazen yanıt hücrelerinin miktarı patojenin kontrol etmek için orantılı değildir<sup&gt; 1</sup&gt;. CTL kaliteli bir önlem özellikle öldürmek için yeteneklerini<sup&gt; 2</sup&gt;. Hedef hücrelerin KAKE etiketleme bu CTL yanıt kalitesini araştırmak için kullanılabilir<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

Antijen Özgül In Vivo</emKAKE Etiketli Hedef Hücreler> Killing Testi

Karboksifloresin diasetat süksinimidil ester (CFSE), in vivo incelemeler için ilgili bir hücre popülasyonunu kolay ve hızlı bir şekilde işaretlemek amacıyla kullanılabilir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, CD sekiz pozitif T hücrelerinin belirli bir antijene yanıt olarak hedef hücreleri in vivo öldürme yeteneklerini inceleyerek fonksiyonel kalitelerini değerlendirmektir. Bu, öncelikle alıcı farelerin immünize edilmesiyle antijene özgü efektör CD sekiz pozitif T hücrelerinin uyarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, primer hedef hücrelere özgüllük kazandırılır veya hücrelere başka bir işlem uygulanır; böylece spesifik efektör hedef sistemi oluşturulmuş olur.Ardından, hedef hücreler retroorbital adaptif transfer yoluyla alıcı farelere verilir. İn vivo efektör öldürme kapasitesini incelemek için, CF SE boyalı hücrelerin akış sitometrik analizine dayanarak efektörlerin herhangi bir hedef hücreyi öldürüp öldürmediğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Merhaba, ben Marina Ward.Wisconsin Madison Üniversitesi'ndeki Gary Splitter laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bu yöntem, CTL öldürme mekanizması hakkında bilgi sağlayacak olup hücre proliferasyonu ve sağkalım çalışmalarına da uygulanabilir. Adoptif transfer prosedürünü laboratuvarımızdan bilim insanı Dr. Jerome Harms gerçekleştirecek. Belirli bir efektör hedef sistemi tanımlayarak stratejik bir başlangıç yapın.Örneğin, klasik bir in vivo CTL analizinde, spesifik CD8 pozitif T hücrelerini uyarmak için saflaştırılmış bir peptid immünizasyonu kullanın ve syngeneik hedef hücreleri pulse etmek için aynı peptidi kullanarak hedef sisteme yönelik spesifik bir etki oluşturun. Enjeksiyonların sterilitesini sağlamak için bir biyogüvenlik kabininin çalışma yüzeyini dekontamine edin. Peptid immünizasyonunu, öncelikle iki mL'lik bir tüpe yerleştirerek hazırlayın.Fare başına 100 µL %10 DMSO içeren PBS içinde 50 µg saflaştırılmış peptid. Ardından, karıştırma için 1 mm boncuklar içeren, çok soğuk, tamamlanmamış serbest unju'dan eşit miktarda ekleyin. Tüp kapağını parafilm ile sabitleyin ve immünojeni enjeksiyona kadar buz üzerinde saklayın.Emülsiyonu karıştırmak için maksimum dakika başına devir ayarına getirilmiş bir boncuk çırpıcı (bead beater) kullanın; karıştırma işlemi üç dakika sürsün ve ardından emülsiyonu hemen tekrar buza yerleştirin. Elde edilen emülsiyonun kıvamı mayoneze benzer olmalıdır. Emülsiyonun dört santigrat derecede gece boyunca veya bir haftaya kadar beklemesine izin verin; immünizasyon sırasında herhangi bir ayrışma fark edilirse tekrar karıştırın.Deneyin bu bölümü için fareleri belirleyin. Emülsiyonu çekmek için bir mililitrelik bir şırınga ve 20 gauge iğne kullanın. Hedef hücreleri hazırlamak amacıyla, herhangi bir boncuk çekmemeye dikkat edin.Naif sinjenik fareler kullanılır ve bu naif fareler ötanize edilir. A-A-A-L-A-C onaylı standartlara uygun olarak, fareden, tüylerden veya diğer dış kontaminanlardan kaynaklanabilecek kontaminasyon riskini en aza indirmek için farenin ilgili bölgesine %70 ethanol püskürtün. Diseksiyon makası kullanarak farenin sol tarafındaki deride küçük bir kesik açın.Periton kesesini ve iç organları açığa çıkarmak için deri flebini kenara çekin. Alttaki organlara zarar vermemeye dikkat ederek peritonu kesin. Yüzeye yakın ve koyu kırmızı renkte olan dalağı bulun.Daleği dikkatlice çıkarın ve derhal buz üzerinde 10 mL hazırlanmış RPMI medium içeren 15 mL'lik konik tüpe yerleştirin. Kalan farelerle işleme devam edin. Daleği ve mediumu cam bir doku homogenizatörüne aktarın.Tüm doku rengini kaybedene kadar dalakla öğütme işlemi gerçekleştirin. Homojenize edilmiş ürünleri 70 mikronluk bir hücre filtresinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Homojenizatörü bir kez taze besiyeri ile durulayın ve filtre üzerinden süzerek dalak homojenatı ile birleştirin; örnekleri dört derece Celsius'ta ve dakikada 1.300 devir hızında santrifüjleyin.Yedi dakika boyunca süpernatantı dekante edin ve atın. Hücre peletini 10 mililitre lizis reaktifi içinde yeniden süspande edin ve 37 °C'de yedi dakika inkübe edin. Taze besiyeri ile 50 mililitreye tamamlayın ve hücreleri santrifüjle hasat edin.Bu yıkama işlemini tekrarlayın. Hücreleri sayın ve 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı doku kültürü plağındaki her kuyucuğa 10 milyon hücre gelecek şekilde paylaştırın.Dört derece Celsius'ta bir buçuk saat boyunca inkübe edin. Son 30 dakika için 37 derece Celsius inkübatöre taşıyın. Taze CFSE reaktifini üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 0.5 ile 25 Micromolar arası bir çalışma konsantrasyonuna seyrelitin.Konsantrasyonları on kat farklı iki CFSE çözeltisi hazırlayın. Etiketlemeden önce, bu düşük ve yüksek konsantrasyonlu CFSE çözeltilerini 37 °C'ye kadar dengeleyin. Hedef hücrelerin bulunduğu 96 kuyucuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve santrifüjleme ile hücreleri pelitleyin.Oda sıcaklığında, SUP süpernatantını uzaklaştırmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 200 µL düşük veya yüksek konsantrasyonlu CFSE çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 15 dakika inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında santrifüjle pelletleyin, SUP süpernatantını uzaklaştırmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 200 µL taze besiyeri içinde yeniden süspande edin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüjle tekrar pelletleyin, süpernatantı dökün ve pelletleri 50 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Etiketlenmiş hücrelerin bir kısmını, veri analizi sırasında transfer edilmeyen kontrollere ve ayrıca adoptif transfer için akış sitometresinde çalıştırmaya ayırın.Fare başına, düşük konsantrasyonlu CFSE işaretli hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğu, yüksek konsantrasyonlu CFSE işaretli hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğa ekleyin. Böylece, ortaya çıkan enjeksiyon 0,1 mililitrede %50 spesifik hedef ve %50 ilgisiz hücreden oluşur. Adoptif transferi kolaylaştırmak için peptit immunize edilmiş fareleri anesteziye alın ve alıcıya retroorbital yol ile 0,1 mililitre işaretli hedef hücre enjekte edin.Altı saat sonra, hücre hasadı için alıcı fareleri ötanize edin, fare dalağını izole edin ve kullanılan aynı protokol ile hücre popülasyonunu saflaştırın. Hedef dalak hücrelerini hazırlarken, hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı doku kültürü plağına kuyucuk başına 1 milyon olacak şekilde ekleyin, geri kazanılan ve transfer edilmeyen hücreleri paraformaldehit ile fikse edin, örnekleri bir akış sitometresinde çalıştırın ve verileri analiz edin. Hücreye özgü öldürme sonuçlarının tipik sunumu iki şekilde gösterilmiştir.FACS histogramındaki azalmış epitop spesifik pik ve hesaplanan değer, hücreye özgü lizistir. Buradaki sayılar; PBS ile immünize edilmiş alıcı bir fareden geri kazanılan CFSE işaretli kontrol hücrelerinde, yüksek veya düşük CFSE fenotipindeki hücrelerin yüzdesini ve iki farklı peptide spesifik alıcı fareden geri kazanılan CFSE işaretli hücrelerin yüzdesini göstermektedir. Hücreye özgü öldürmeye işaret eden azalmış epitop spesifik pklere dikkat ediniz.Alternatif olarak, sonuçlar her fare grubu için hücreye özgü lizisi belirtecek şekilde grafiksel olarak sunulabilir: PBS, peptid A ve peptid B. Bu videoyu izledikten sonra, fareler kullanarak kendi in vivo CTL öldürme analizini nasıl geliştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

antigen-specific-in-vivo-killing-assay-using-cfse-labeled-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

KAKE kovalent, floresan boya, carboxyfluorescein uzun ömürlü hücre içi moleküller etiketler. Gibi KAKE etiketli hücre böler, döl ve böylece hücre bölünmesini değerlendirmek için kullanılan floresan yarısı miktarı, var. Bu makalede, tipik olarak KAKE fare lenfositler etiketlenmesi için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.

Lenfosit Silahların Yayılmasının Önlenmesi Monitör Carboxyfluorescein diasetat Succinimidyl Ester (KAKE) Kullanımı

Fonksiyonel T-hücre deneylerinde antijen kaynağı olarak kullanılacak insan doku özleri hazırlamak için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku-türetilmiş antijenleri ile T-hücresi yanıtı ölçülmesine imkan...

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Video, sitotoksik T lenfositlerinde veya CTL yanıtlarında immünodominansı test etmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Enjekte edilen floresan hedef hücreler, immünojenik epitoplara karşılık gelen değişen floresan sergiler. Dalak sonrası toplama ve sınıflandırma, yüksek yoğunluklu floresan hücrelerde bir azalma olduğunu ortaya koyarak CTL yanıtlarında immünodominansı doğrular.

Sitotoksik T Lenfosit Yanıtlarında İmmün Baskınlığı Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Burada sunulan bir protokol Proliferasyona CD4+ T hücreleri antijenik proteinler veya peptidler boya seyreltme kullanarak yanıt olarak. Bu tahlil nadir antijen özgü T hücrelere özellikle duyarlıdır ve antijen özgü hücrelerin klonlama kolaylaştırmak için değiştirilebilir.

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Öğrenin farelerde CD8+ T hücrelerinin in vivo sitotoksik aktivitesini CFSE etiketleme ve akış sitometrisi ile değerlendirme yöntemini. Bu protokol, antijen-spesifik hücre öldürme kapasitesini nicel olarak ölçer.

Antijen Özgül In Vivo Killing Testi

Daha fazla video keşfet