Antijen Özgül In Vivo Killing Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, CD sekiz pozitif T hücrelerinin belirli bir antijene yanıt olarak hedef hücreleri in vivo öldürme yeteneklerini inceleyerek fonksiyonel kalitelerini değerlendirmektir. Bu, öncelikle alıcı farelerin immünize edilmesiyle antijene özgü efektör CD sekiz pozitif T hücrelerinin uyarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, primer hedef hücrelere özgüllük kazandırılır veya hücrelere başka bir işlem uygulanır; böylece spesifik efektör hedef sistemi oluşturulmuş olur.

Ardından, hedef hücreler retroorbital adaptif transfer yoluyla alıcı farelere verilir. İn vivo efektör öldürme kapasitesini incelemek için, CF SE boyalı hücrelerin akış sitometrik analizine dayanarak efektörlerin herhangi bir hedef hücreyi öldürüp öldürmediğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Merhaba, ben Marina Ward.

Wisconsin Madison Üniversitesi'ndeki Gary Splitter laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bu yöntem, CTL öldürme mekanizması hakkında bilgi sağlayacak olup hücre proliferasyonu ve sağkalım çalışmalarına da uygulanabilir. Adoptif transfer prosedürünü laboratuvarımızdan bilim insanı Dr. Jerome Harms gerçekleştirecek. Belirli bir efektör hedef sistemi tanımlayarak stratejik bir başlangıç yapın.

Örneğin, klasik bir in vivo CTL analizinde, spesifik CD8 pozitif T hücrelerini uyarmak için saflaştırılmış bir peptid immünizasyonu kullanın ve syngeneik hedef hücreleri pulse etmek için aynı peptidi kullanarak hedef sisteme yönelik spesifik bir etki oluşturun. Enjeksiyonların sterilitesini sağlamak için bir biyogüvenlik kabininin çalışma yüzeyini dekontamine edin. Peptid immünizasyonunu, öncelikle iki mL'lik bir tüpe yerleştirerek hazırlayın.

Fare başına 100 µL %10 DMSO içeren PBS içinde 50 µg saflaştırılmış peptid. Ardından, karıştırma için 1 mm boncuklar içeren, çok soğuk, tamamlanmamış serbest unju'dan eşit miktarda ekleyin. Tüp kapağını parafilm ile sabitleyin ve immünojeni enjeksiyona kadar buz üzerinde saklayın.

Emülsiyonu karıştırmak için maksimum dakika başına devir ayarına getirilmiş bir boncuk çırpıcı (bead beater) kullanın; karıştırma işlemi üç dakika sürsün ve ardından emülsiyonu hemen tekrar buza yerleştirin. Elde edilen emülsiyonun kıvamı mayoneze benzer olmalıdır. Emülsiyonun dört santigrat derecede gece boyunca veya bir haftaya kadar beklemesine izin verin; immünizasyon sırasında herhangi bir ayrışma fark edilirse tekrar karıştırın.

Deneyin bu bölümü için fareleri belirleyin. Emülsiyonu çekmek için bir mililitrelik bir şırınga ve 20 gauge iğne kullanın. Hedef hücreleri hazırlamak amacıyla, herhangi bir boncuk çekmemeye dikkat edin.

Naif sinjenik fareler kullanılır ve bu naif fareler ötanize edilir. A-A-A-L-A-C onaylı standartlara uygun olarak, fareden, tüylerden veya diğer dış kontaminanlardan kaynaklanabilecek kontaminasyon riskini en aza indirmek için farenin ilgili bölgesine %70 ethanol püskürtün. Diseksiyon makası kullanarak farenin sol tarafındaki deride küçük bir kesik açın.

Periton kesesini ve iç organları açığa çıkarmak için deri flebini kenara çekin. Alttaki organlara zarar vermemeye dikkat ederek peritonu kesin. Yüzeye yakın ve koyu kırmızı renkte olan dalağı bulun.

Daleği dikkatlice çıkarın ve derhal buz üzerinde 10 mL hazırlanmış RPMI medium içeren 15 mL'lik konik tüpe yerleştirin. Kalan farelerle işleme devam edin. Daleği ve mediumu cam bir doku homogenizatörüne aktarın.

Tüm doku rengini kaybedene kadar dalakla öğütme işlemi gerçekleştirin. Homojenize edilmiş ürünleri 70 mikronluk bir hücre filtresinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Homojenizatörü bir kez taze besiyeri ile durulayın ve filtre üzerinden süzerek dalak homojenatı ile birleştirin; örnekleri dört derece Celsius'ta ve dakikada 1.300 devir hızında santrifüjleyin.

Yedi dakika boyunca süpernatantı dekante edin ve atın. Hücre peletini 10 mililitre lizis reaktifi içinde yeniden süspande edin ve 37 °C'de yedi dakika inkübe edin. Taze besiyeri ile 50 mililitreye tamamlayın ve hücreleri santrifüjle hasat edin.

Bu yıkama işlemini tekrarlayın. Hücreleri sayın ve 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı doku kültürü plağındaki her kuyucuğa 10 milyon hücre gelecek şekilde paylaştırın.

Dört derece Celsius'ta bir buçuk saat boyunca inkübe edin. Son 30 dakika için 37 derece Celsius inkübatöre taşıyın. Taze CFSE reaktifini üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 0.5 ile 25 Micromolar arası bir çalışma konsantrasyonuna seyrelitin.

Konsantrasyonları on kat farklı iki CFSE çözeltisi hazırlayın. Etiketlemeden önce, bu düşük ve yüksek konsantrasyonlu CFSE çözeltilerini 37 °C'ye kadar dengeleyin. Hedef hücrelerin bulunduğu 96 kuyucuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve santrifüjleme ile hücreleri pelitleyin.

Oda sıcaklığında, SUP süpernatantını uzaklaştırmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 200 µL düşük veya yüksek konsantrasyonlu CFSE çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 15 dakika inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında santrifüjle pelletleyin, SUP süpernatantını uzaklaştırmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 200 µL taze besiyeri içinde yeniden süspande edin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüjle tekrar pelletleyin, süpernatantı dökün ve pelletleri 50 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Etiketlenmiş hücrelerin bir kısmını, veri analizi sırasında transfer edilmeyen kontrollere ve ayrıca adoptif transfer için akış sitometresinde çalıştırmaya ayırın.

Fare başına, düşük konsantrasyonlu CFSE işaretli hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğu, yüksek konsantrasyonlu CFSE işaretli hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğa ekleyin. Böylece, ortaya çıkan enjeksiyon 0,1 mililitrede %50 spesifik hedef ve %50 ilgisiz hücreden oluşur. Adoptif transferi kolaylaştırmak için peptit immunize edilmiş fareleri anesteziye alın ve alıcıya retroorbital yol ile 0,1 mililitre işaretli hedef hücre enjekte edin.

Altı saat sonra, hücre hasadı için alıcı fareleri ötanize edin, fare dalağını izole edin ve kullanılan aynı protokol ile hücre popülasyonunu saflaştırın. Hedef dalak hücrelerini hazırlarken, hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı doku kültürü plağına kuyucuk başına 1 milyon olacak şekilde ekleyin, geri kazanılan ve transfer edilmeyen hücreleri paraformaldehit ile fikse edin, örnekleri bir akış sitometresinde çalıştırın ve verileri analiz edin. Hücreye özgü öldürme sonuçlarının tipik sunumu iki şekilde gösterilmiştir.

FACS histogramındaki azalmış epitop spesifik pik ve hesaplanan değer, hücreye özgü lizistir. Buradaki sayılar; PBS ile immünize edilmiş alıcı bir fareden geri kazanılan CFSE işaretli kontrol hücrelerinde, yüksek veya düşük CFSE fenotipindeki hücrelerin yüzdesini ve iki farklı peptide spesifik alıcı fareden geri kazanılan CFSE işaretli hücrelerin yüzdesini göstermektedir. Hücreye özgü öldürmeye işaret eden azalmış epitop spesifik pklere dikkat ediniz.

Alternatif olarak, sonuçlar her fare grubu için hücreye özgü lizisi belirtecek şekilde grafiksel olarak sunulabilir: PBS, peptid A ve peptid B. Bu videoyu izledikten sonra, fareler kullanarak kendi in vivo CTL öldürme analizini nasıl geliştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.