Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- _{L homosistein bağlayıcı Proteinler}

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yakalama bileşiği kütle spektrometrisi veya CCMS ile karmaşık protein karışımlarındaki metil transferazların profilini çıkarmaktır. Metil transferazlar, genel metiltransferaz ürün inhibitörü olan S adenil, L homosistin kısa, SAH'ı seçicilik fonksiyonu olarak taşıyan üç fonksiyonlu yakalama bileşikleri ile fonksiyonel olarak izole edilir; burada gösterilen iş akışında fonksiyonel izolasyon, ikinci bir adım olarak yakalama bileşiğinin seçicilik fonksiyonu ile hedef proteinler arasında tersinir bir bağlanma dengesi kurmak için bir hücre lizatının yakalama bileşiği ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Karışım, yakalama kutusu içerisinde UV ışığı ile ışınlanır.

Işınlama fotoğrafı, yakalama bileşiğinin reaktivite fonksiyonunu aktive eder. Bu, yakalama bileşiği ile hedef proteinler arasında geri dönüşümsüz bir kovalent çapraz bağ oluşumunu tetikler. Daha sonra, yakalama bileşiği protein konjugatları lizattan ayrılır, iyice yıkanır, katı destekten serbest bırakılır ve yakalanan proteinlerin triptik peptitlerin kütle spektrometrik analizi ile tanımlanması için tripsinize edilir; sonuçlar, yakalama bileşiği kütle spektrometrisi temel alınarak esia coli hücre lizatından metiltransferazların doğrudan izolasyonunu ve tanımlanmasını göstermektedir.

Merhaba, ben Biyokimya Bölümü CaTECH Laboratuvarı'ndan Thomas Lentz. Ben de yine CapTech Biyokimya Laboratuvarı'ndan Mathias Rega. Ben de analitik departmanından Mer Linsky.

Bugün size, eşitlenmiş hücre lizatından metil transferazların on-bead yakalanması prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü küçük molekül-protein etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Bu prosedür; kinazlar, metaloproteinazlar ve birkaç örnek vermek gerekirse GTPazlar gibi fonksiyonel alt proteomların izolasyonuna ve tanımlanmasına olanak tanır.

Bu yaklaşımı ilaç hedef keşfi için de kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Yakalama deneyleri için, snail L homocystine caper kiti (kısa SAH caper kiti) kullanılır.

Bu kit, SAH yakalama bileşiğini ve rakip olarak serbest SAH'ı içermektedir. Ayrıca, bir mikron çapında streptavidin kaplı manyetik boncuklar, beş kat konsantre yakalama tamponu ve beş kat konsantre yıkama tamponu da yer almaktadır. Bir adet 200 microliter PCR tüp şeridinin farklı tüplerini kullanarak, her bir tüp için 10 milligrams per milliliter'lık streptavidin kaplı manyetik boncukların 50 microliters'ı ile 100 micromolar SAH yakalama bileşiğinin 25 microliters'ını karıştırarak SAH yakalama bileşiği yüklü streptavidin kaplı manyetik boncuklar hazırlayın ve kuvvetlice çalkalayın.

Yakalama bileşiğinin biotin kısmının manyetik boncuk yüzeyindeki streptavidine bağlanmasını sağlamak için elde edilen süspansiyonları oda sıcaklığında iki dakika boyunca çalkalayın. Ardından, capra mag kullanarak capra boncuklarını PCR tüplerinin kapaklarında manyetik olarak toplayın, süpernatanı dökün ve elde edilen capra boncuklarını 200 µL bir kat (1x) yıkama tamponunda yeniden süspande edin. Capra boncuklarını PCR tüp şeritlerinin kapaklarında tekrar manyetik olarak toplayın ve süpernatanı dökün.

Ardından, boncukların kurumasını önlemek için tüpleri kapatın. Daha sonra, kompetisyon kontrolü de dahil olmak üzere yakalama deneyi ve gerekli kontroller için yeni tüpleri etiketleyin. Çökeltme kompetisyon kontrolü ile çökeltme ve kombine yakalama deneyi artı çökeltme tüplerini hazırlayın; etiketli tüpleri sıcaklığı 0 ila 4 °C arasında düzenlemek için capra kutusuna yerleştirin.

Ardından, 100 µL nihai reaksiyon hacmi için hesaplanan miktarda milli Q su ve 20 µL beş kat capture tamponu pipetleyin. Her reaksiyon için, her tüpe 0.26 mg E. coli DH5α bütün hücre lizatı ekleyin ve ters çevirme yöntemiyle nazikçe karıştırın. Kompetisyon kontrolü ve pull-down kompetisyon kontrolü için 20 µL 10 mM SAH kompetitör çözeltisi ekleyin.

Yakalama testi, çöktürme ve yakalama testi ile çöktürme kombinasyonu için SAH çözeltisi yerine 20 µL milli Q su ekleyin, tüm tüpleri ters çevirerek nazikçe karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin. Ardından capra boncuklarını ilgili lizatta süspande edin ve dört °C'de üç saat boyunca inkübe edin. SAH bağlayan proteinlerin, SAH yakalama bileşiğinin SAH seçicilik fonksiyonuna tersinir şekilde bağlanmasını sağlamak için boncukları rotasyonla süspansiyonda tutun.

İnkübasyonun ardından, kısa süreli olarak santrifüjleyin ve süspansiyonları kapra kutusuna yerleştirin. Tüpleri ayırın ve pull down ile pull down'ın kompetisyon kontrolü için süspansiyonları buz üzerine alın. Geri kalan süspansiyonları yakalama deneyi kompetisyon kontrolü ve kombine yakalama deneyi için bırakın.

Numuneleri aynı anda soğuturken UV ışığı ile ışınlamak için capra kutusundaki çekme kolunu aşağı çekin. Numuneleri, kapalı tüpler içerisinde 0 ve 4 °C arasında, 2,5 dakikalık ışınlama aralıklarıyla toplam 30 dakika boyunca ışınlayın. Bu işlem, SAH yakalama bileşiğinin reaktivite fonksiyonu ile SAH bağlayıcı proteinler arasında kovalent bir çapraz bağ oluşturacaktır.

Süspansiyonları 2,5 dakikalık bir ışınlama aralığının ardından Capra kutusundan çıkarın. Yaklaşık 15 saniye boyunca buzlu suda soğutun ve birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Ardından, kapaklarda kalan süspansiyonları uzaklaştırmak için numuneleri kısaca santrifüjleyin ve bir sonraki ışınlama aralığı için tekrar capra kutusuna yerleştirin.

Ardından, pull down ve pull down'un kompetisyon kontrolü için süspansiyonları ekleyin; kompetisyon kontrolü, pull down kompetisyon kontrolü ve kombine capture assay artı pull down için capture assay'e 20 µL 10 mM SAH çözeltisi ekleyin, diğerlerine 20 µL milli Q su ekleyin. Süspansiyonları 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin ve capture assay'de boncukları ve süspansiyonu rotasyonla tutun. SAH capture bileşiğine çapraz bağlanmamış SAH bağlayıcı proteinler yer değiştirecektir.

İnkübasyonun ardından, capra bead'leri capra mag kullanarak süspansiyonlardan toplayın ve süpernatantı atın. Ardından, bead'leri 200 µL bir katı yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek ve manyetik ayırma ile toplayarak yıkayın. Bu yıkama işlemini beş kez tekrarlayın, ardından bead'leri 200 µL milli Q suyunda yeniden süspanse edin ve manyetik ayırma ile toplayın.

Boncukları 200 µL %60 asetonitril içinde yeniden süspande edin ve capri mag kullanarak boncukları toplayın. Bu asetonitril yıkamasını iki kez tekrarlayın. Boncuklar kolayca yeniden süspande edilemezse ultrason uygulayın.

Ardından, taze hazırlanmış 200 µL %60 asetonitril, %0,2 trifloroasetik asit ekleyip oda sıcaklığında şiddetli çalkalama altında 10 dakika inkübasyon yaparak yakalanan proteinleri boncuklardan ayırın. Boncuklar kolayca yeniden süspanse edilemiyorsa tekrar ultrason uygulayın.

Son olarak boncukları manyetik olarak toplayın ve atın. Tüp şeridini tekli tüpler halinde kesin, kapakları delin ve süpernatantı kuruyana kadar uçurun. Bu aşamada, santrifüjlü evaporatör kullanarak yakalanan proteinler ya SDS page işlemine tabi tutulabilir ya da sonraki bölümde açıklandığı gibi kütle spektrometrisi için işlenebilir; manyetik boncuklardan salınan yakalanmış proteinleri 10 µL 50 mM amonyum bikarbonatta çözün.

Numuneleri bir ultrasonik banyoya yerleştirin, ardından numuneleri vorteksleyin. Sonrasında, 1 mM HCL içinde 0,5 µg/µL tripsin içeren bir mikrolitre ekleyin, kısa süreli santrifüjleyin ve çözeltiyi 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, yakalanan proteinlerin tripsitik peptidlerini içeren çözeltiyi, üretici talimatlarına uygun olarak biosystems marka 20 µL stage tips gibi C 18 materyalleri kullanarak tuzdan arındırın; peptidleri 10 µL %50 metanol ve %5 formik asit ile iki kez elüe edin.

Ardından, solventi santrifüj evaporatör kullanarak uçurun ve kuru tuzsuz peptitleri bırakın; peptitleri, bir ultrason banyosunda ultrason uygulayarak ve vorteksleyerek 5,5 µL %0,1 formik asit içinde çözün. Son olarak, yazılı protokolde açıklandığı şekilde, tandem kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş nano akış sıvı kromatografisi ile örneği analiz edin. MS/MS verilerini analiz etmek için, BioWorks tarayıcı sürümü 3.3 0.1'de uygulanan SEQuest, SPonne ve Scaffold 3 yazılımında uygulanan X!Tandem gibi bir protein tanımlama algoritması kullanın.

Otomatik veri tabanı araması, en güncel evrensel protein kaynağı bilgi tabanına karşı gerçekleştirilir. İncelenen organizma için www.uniprot.org adresinde yayınlanan Swiss-Prot veri tabanı kullanılır.

Bu çalışmada kullanılan veri tabanı, 5 ppm öncül toleransı, 1 atomik kütle birimi fragman iyon toleransı ve ikiye kadar kaçırılmış cleavage'a izin veren tam tripsin spesifitesi ile Seaquest üzerinden otomatik veri tabanı aramasıyla kurulan bir coli suşu K12 release 57 dash 11'dir.

Serin, treonin ve tirozin üzerinde fosforilasyon; metiyonin üzerinde oksidasyon; asparagin ve glutamin üzerinde deamidasyon; lizin üzerinde asetilasyon; lizin üzerinde formilasyon; arginin, lizin, serin, treonin ve asparagin üzerinde ise metilasyon yapılabilmesi için değişken modifikasyonları ayarlayın. Veritabanı aramasında sabit modifikasyonlar kullanmayın. Seaquest tarafından oluşturulan DTA veya SRF dosyalarını; Seaquest ve Xtend tandem veritabanı aramalarını birleştirerek peptit atamalarının ve protein tanımlamalarının olasılık değerlendirmesini gerçekleştiren Scaffold 3 yazılımına yükleyin. Scaffold, birkaç örneğe ait protein listelerini kolayca karşılaştırmak, doğrulamak ve görselleştirmek için kullanışlıdır.

Scaffold Three yazılımındaki parametreleri, yalnızca protein tanımlamasını kabul edecek ve bunları ayrı vuruşlar olarak raporlayacak şekilde ayarlayın. Vuruşların, olasılık doğrulamasını geçmiş en az bir ayırt edici peptit içermesini sağlayın. Scaffold Three analizine göre, yalnızca Scaffold içerisindeki peptit profit algoritması tarafından belirtilen %95 ve üzeri olasılığa sahip peptitleri dikkate alın.

Üç yazılım, protein profit algoritmasına göre, birden fazla peptit atamasına sahip protein tanımlama olasılıklarını %95 veya daha yüksek olarak ayarladı. Tek peptitli protein tanımlamaları için protein olasılığı keyfi olarak %50 veya daha yüksek şeklinde ayarlanmış ve ilgili peptitler manuel olarak incelenmiştir. Sadece MS/MS analizine dayanarak ayırt edilemeyen ve benzer peptitler içeren MS/MS spektrumu proteinleri, tutumluluk ilkelerini karşılamak amacıyla yazılım tarafından gruplandırılmıştır.

Peptit tanımlamalarının tahmini yanlış keşif oranı, ters protein veri tabanı yaklaşımı kullanılarak belirlenebilir ve %1'den düşük olmalıdır. Yakalama analizinde, yakalanan sağlam proteinlerin SDS page ve gümüş boyama analizi gösterilmiştir. UV ışınlama adımından sonra, yalnızca foto-reaktivite fonksiyonu aracılığıyla yakalama bileşiği kovalent olarak bağlı olan proteinlerin izole edilmesini sağlamak için fazla miktarda serbest SAH eklenmiştir.

Proteinler, Ingel Triptych Digest sonrası kesilen protein jel bantlarından MS ile tanımlanmıştır. Karşılaştırma amacıyla, en soldaki şerit, yakalama analizinde proteinlerin izole edildiği e coli DH five alpha tüm hücre lizatının %0,25'ini göstermektedir. Bu karşılaştırma, yakalama bileşiği teknolojisi ile elde edilen örnek karmaşıklılığındaki çarpıcı azalmayı ortaya koymaktadır.

Kontroller jel merkezinde çalıştırılmış olup analizin rekabet kontrolünü içermektedir. Bu kontrol, SAH seçicilik fonksiyonu aracılığıyla proteinlerin SAH yakalama bileşiğine bağlanmasını önlemek için UVI radyasyon adımından önce rakip olarak fazla miktarda serbest SAH içerir. Rekabet kontrolü, SAH'a bağlanmayan, spesifik olmayan şekilde yakalanan proteinlerin belirlenmesi için gereklidir.

Böylece, yakalama analizinde tanımlanan ancak rekabet kontrolünde tanımlanmayan proteinler, spesifik SAH bağlayan proteinlerdir. Ayrıca, UV ışınlaması yapılmayan ve serbest SAH eklenmeyen bir pull-down deneyi de dahil edilmiştir.

Çekme (pull down) işleminin yarışma kontrolü de ışınlanmamıştır, ancak rakip olarak SAH içerir. Son olarak, yakalama deneyi ve çekme işleminin kombinasyonu UV ile ışınlanmış olup iş akışı sırasında serbest SAH eklenmemiştir. Fotoyapısal çapraz bağlamanın deneyin verimini ve hassasiyetini artırdığı açıktır; özgünlük ise yakalanan sağlam proteinlerin SDS-PAGE ile analizi yerine, fazla miktarda serbest SAH kullanılarak yapılan yarışma deneyleriyle kolayca test edilebilir.

Yakalanan proteinlerin tüm karışımı, Triptik Sindirim sonrası tandem kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş nano akış sıvı kromatografisi ile tek seferde analiz edilebilir. Bu, gerçek CCMS yaklaşımıdır ve SDS-PAGE ile yapılan analizden çok daha hassastır. CCMS deneyleri ile tanımlanan METİLTRANSFERAZLAR ve seçilen diğer proteinler bu tabloda gösterilmiştir.

Verilen sayılar, protein başına ağırlıklandırılmamış peptid spektral sayısını belirtmektedir; yakalama deneyiyle, pull-down yöntemine kıyasla çok daha fazla metiltransferaz ve diğer SAH bağlayıcı proteinler tanımlanmıştır. SAH özgüllüğü, rekabet kontrolünde bu proteinlerin neredeyse tamamen yokluğu ile gösterilmiştir. CCMS analizlerinde tanımlanan toplam protein sayısı ve analizler arasındaki protein örtüşmesi tablo haline getirilmiştir.

En az iki peptitle tanımlanan proteinlerin sayısı parantez içinde verilmiştir. Yöntemin yüksek tekrarlanabilirliği, karşılaştırılabilir deneyler arasında, özellikle burada en az iki peptitle güçlü bir şekilde tanımlanan proteinlerde, temel olarak spesifik olmayan proteinlerin yüksek protein örtüşmesinden çıkarılabilir. Venn diyagramları, yakalama deneyi, yarışma kontrolü ve pull down işlemlerinde tanımlanan proteinlerin örtüşmesini tanımlarken; tüm tanımlanan proteinlerin sayıları sağda, en az iki peptitle tanımlanan proteinlerin sayıları ise parantez içinde verilmiş, metil transferazların ve SAH nükleazların sayıları ise solda gösterilmiştir.

Yakalama bileşiği kütle spektrometrisi veya CCMS yoluyla, E. coli hücre lizatından veya diğer doku ya da hücre lizatlarından metil transferazların veya diğer fonksiyonel alt proteomların nasıl izole edileceğini ve tanımlanacağını size gösterdik. Bu prosedürü uygularken, örnekleri soğuk tutmak için yakalama bileşiğinin görünür ışığa uzun süre maruz kalmasından kaçınmanın önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, yakalanan proteinleri manyetik boncuklardan serbest bırakmak için kullanılan TFA Asetonitril çözeltisini taze olarak hazırlayın ve tozdan veya deney görevlisinden kaynaklanan keratin gibi dış protein kaynaklarının deneyleri kirletmesini önleyin.

Ayrıca, ön yakalama bileşiği ile proteinler ve çözelti arasında gerçekleşen farklı konfigürasyonun mu, yoksa şu an açıklanan standart konfigürasyonun mu daha iyi performans gösterdiğinin spesifik düzeneğe bağlı olduğunu belirledik. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.