Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Sinirbilimciler, beyindeki nöronların nasıl iletişim kurduğunu araştırarak beynin işlevini incelerler. Burada, dinamik klem tekniği kullanılarak deneysel olarak kontrol edilen bir iletkenlik uygulandığında, tek bir nöronun elektriksel aktivitesindeki değişiklikler tetiklenir. İlk olarak, ince sarmal beyin dilimleri kesilir ve yapay serebrospinal sıvı ile doldurulmuş bir inkübasyon odasında saklanır.

Ardından bir kesit, patch clamp kayıt düzeneğine aktarılır. Bir nöron seçilir ve kayıt amplifikatörüne bağlı bir dinamik klempleme bilgisayarı kullanılarak bir kayıt elektrodu ile patch yapılır. Hücreye bir NMDA reseptör iletkenliği uygulanır.

Elde edilen kayıtlar, NMDA reseptörlerinin aktivasyonunun, dopaminerjik nöronların burstler oluşturabilmesini sağlayan hücresel mekanizmalardan biri olduğunu gösteren bir aksiyon potansiyeli burstü sergilemektedir. Bu tekniğin, doğrudan akım enjeksiyonu veya farmakolojik tedavi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, deneysel olarak tanımlanmış bir reseptörün aktivasyonunun yaşayan bir nöronun elektriksel aktivitesi üzerindeki etkilerini kesin olarak belirleyebilmemizdir. Anestezize edilmiş bir Bragg dolly sıçanın beyni hızla çıkarıldıktan sonra, titreşimli bir mikrotom kullanılarak 240 micrometer kalınlığında yatay beyin kesitleri hazırlandı.

Kesitler alındıkça, kayıt deneylerini gerçekleştirme zamanı gelene kadar, bunları yapay beyin omurilik sıvısı ile doldurulmuş 32 °C'lik bir inkübasyon odasına yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın. Hücre içi kayıt düzeneği; gradyan kontrast görüntüleme için ayarlanmış objektiflere sahip bir mikroskop, bir monitör, bir perfüzyon sistemi, bir multi clamp 700 B amplifikatörü, bir analogdan dijitale dönüştürücü, bir mikro manipülatör ve kafa ünitesinden oluşur. Bir Mac Pro bilgisayar, veri toplama yazılımı olan Axo Graph X ve multi clamp commander yazılımını çalıştırır; hücre içi kayıt düzeneğinin ve Mac Pro bilgisayarın yanında, dinamik klempleme tekniği ile birlikte kullanılacak olan analogdan dijitale dönüştürücüsüyle beraber gerçek zamanlı Linux çalıştıran bir Sun Microsystems bilgisayar bulunur.

Hücre içi kayıt düzeneği, yaklaşık 35 °C sıcaklıkta yapay beyin omurilik sıvısı perfüzyonu gerçekleştirmelidir. Kayıt yapılacak kesit yatay olarak hazırlandıysa, bir transfer pipeti kullanarak kesiti yapay beyin omurilik sıvısı içeren bir Petri kabına yerleştirin ve bir kesme aleti kullanarak kesiti orta hat boyunca ikiye bölün. Ardından, elektrofizyolojik kayıtlar yapmak için bir pipet yardımıyla kesiti hücre içi kayıt düzeneğine aktarın.

40 x objektifi kullanarak buradaki hedef nöronu görüntüleyin; tek bir substantia nigra dopaminerjik nöronu görülmektedir. İki adet uzanan dendritli, eliptik şekilli somayı not edin. Elektronik bir P 97 mikro pipet çekici kullanarak 4 ile 10 mega ohm uç direncine sahip elektrotlar çekin.

Ardından, bir mikro dolum şırınga iğnesi kullanarak bir elektrodu iç çözelti ile doldurun. Doldurulmuş elektrodu, küçük bir tüp parçasıyla yarı hücreye bağlı bir şırınga kullanarak, amplifikatörün kafa aşamasına bağlı olan yarı hücrenin içine yerleştirin. Kayıt elektroduna az miktarda pozitif basınç uygulayın.

Görsel kılavuzluk altında, elektrodu hedef nörona doğru indirin. Hücre yüzeyinde bir çöküntü görülecektir. İstenen nöron üzerinde bir giga seal oluşturmak için düşük miktarda negatif basınç uygulayın.

Mühürlemeden sızdırmazlığı bozmak için ağızla vakum uygulayın. Bu işlem, tüm hücre kaydı (whole cell recording) aşamasını oluşturur. Sızdırmazlık bozulduktan sonra, amplifikatörü akım enjekte edilemeyen akım kenetleme (current clamp) moduna getirmek için multi clamp commander yazılım arayüzünü kullanın.

Bu hücreye bir NMDA iletkenliği uygulamak için, öncelikle dinamik klemper bilgisayarında RTXI yazılımını çalıştırın. Ardından, hafızaya NMDA reseptörü içeren özel olarak yazılmış bir model yükleyin. Model RTX hafızasına yüklendiğinde, G-N-M-D-A'nın sıfır nanosiemens olarak ayarlandığı ve istenen iletkenliğin nanosiemens cinsinden olduğu burada gösterilen denklem kullanılarak hücreye enjekte edilecek akımı gerçek zamanlı olarak hesaplayacağım.

Semens varsayılan olarak MG magnezyum konsantrasyonudur. E-N-M-D-A, NMDA reseptörü için sıfır milivolta ayarlanmış geri dönüş potansiyelidir ve VM, amplifikatörden milivolt cinsinden ölçülen hücrenin membran potansiyelidir. Şimdi standart BNC kablosu ile dinamik klemper bilgisayarından gelen çıkışı, bir analog-dijital dönüştürücü aracılığıyla amplifikatörün komut girişine bağlayın.

Multi Clamp Commander yazılım arayüzünü kullanarak amplifikatörü standart akım kenetleme (current clamp) moduna getirin. RTXI, Axo Graph X veri toplama yazılımından gelen bir voltaj sinyalinden istenen GFT iletkenliğini alacak şekilde ayarlanmıştır. Burada, hücreye bir saniyelik 40 nano Siemens iletkenlik basamağının uygulandığı basit bir AXO Graph X protokolü yürütüyoruz.

Bu videoda açıklanan düzenek kullanılarak kondüktans basamağına yanıt olarak bir aksiyon potansiyelleri patlaması uyarılmıştır; substantia nigra pars compacta'daki dopaminerjik bir nörondan tüm hücre somatik kaydı gerçekleştirilmiştir. Dopaminerjik hücreler tipik olarak pacemaker benzeri bir paternle düşük hızlarda spontan olarak ateşleme yapar. Dinamik klemple NMDA reseptör kondüktansının fazik uygulamasıyla bir aksiyon potansiyelleri patlaması uyarılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, izole bir beyin kesitindeki canlı bir dopaminerjik nörona NMDA iletkenliğinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bununla birlikte, bu teknik standart elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak kaydı yapılabilen herhangi bir hücre tipi için kullanılabilir. Benzer şekilde, dinamik klempe geniş bir reseptör tipi yelpazesinin elektriksel etkilerini taklit etmek için genişletme yapılabilir.

Bu videonun, dinamik klem tekniğinin ne olduğunu ve laboratuvarımızda bunu nasıl kullandığımızı göstermede faydalı olduğunu umuyoruz. İzlediğiniz için teşekkürler.