Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hastalıkla ilişkili olanlar gibi belirli bir DNA varyantının, belirli bir genin ekspresyonu üzerinde etkisinin olup olmadığını test etmektir. Bu, hem söz konusu varyant hem de ilgilenilen gendeki kodlayan bir snip için heterozigot olan hücre hatlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hücrelerden DNA ve RNA ekstrakte edilir ve ardından bunlar allel spesifik primer uzama reaksiyonu için kalıp olarak kullanılır.

Ardından, iki alelin göreceli bolluğunu belirlemek amacıyla birincil uzama ürünleri kütle spektrometrisi ile analiz edilir. Kütle spektrometrisi ile yapılan kantitatif alele özgü ölçümlere dayanarak, hastalıkla ilişkili orijinal DNA varyantının gen ekspresyonundaki bir farkla da ilişkili olup olmadığını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin temel avantajları, lusiferaz raporlayıcı gen analizinin aksine moleküler manipülasyon gerektirmemesi ve gen ekspresyonunun endojen seviyelerini ölçmesidir.

Dahası, iki alel arasındaki ekspresyon seviyelerini dahili olarak kontrollü bir şekilde karşılaştırabiliyoruz, bu da deneysel değişkenliğin bir kısmını ortadan kaldırıyor. Bu yöntem, genetik ilişkilerin altında yatan moleküler mekanizmalar gibi insan genetiği alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı oluyor. Bu yöntemin fikrini ilk kez, üç geni kapsayan bir genetik ilişki tespit ettiğimizde ve sinyali tek bir gene indirgeyemediğimizde geliştirdik.

Daha ileri genetik haritalama ile. Bu analiz için kullanılan hücreler, hem ilgilenilen geni eksprese etmeli hem de iki temel genotipik gerekliliği karşılamalıdır. Hem hastalıkla ilişkili DNA dizileri hem de transkriptleri kromozomal kökenlerine göre ayırt edebilen DNA markörleri açısından heterozigot olmaları gerekir. Burada gösterilen hücre hattı seçim stratejisinde, A ve B hücre hatları, üçgenlerle temsil edilen transkribe edilen bir kodlayan markör için heterozigottur.

Ancak, Omnicell hattı A, dairelerle temsil edilen ve risk DNA varyantı olarak adlandırılan hastalıkla ilişkili DNA dizisi için heterozigottur. Risk varyantının mavi aleli, daha düşük bir transkripsiyon düzeyi ile ilişkilidir. Tedarikçinin spesifikasyonlarına göre bir flask içindeki hücre hattı kültürünü seçtikten sonra, bu gösterimde fibroblastlar kullanacağız. Bu analiz, primer hücreler de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri için de aynı şekilde uygulanabilir olsa da, sırasıyla DNA ve RNA ekstraksiyonları için iki adet 10 santimetrelik petri kabı hazırlayın.

Hücreler %80 konfluense ulaştığında, seçilen hücre tipine uygun ticari kitler de dahil olmak üzere standart yöntemler kullanılarak DNA ve RNA ekstraksiyonları için hasat edilebilirler. Bu testi gerçekleştirmeden önce, her bir DNA markörü için iki çift PCR primeri tasarlayın; bir çift genomik DNA amplifikasyonu, diğeri ise cDNA amplifikasyonu içindir. Genomik kontaminasyonu önlemek için cDNA amplifikasyonu için ileri ve geri primerleri farklı ekzonlara yerleştirin. Her hücre hattı için uzunluğu 100 ile 500 baz çifti aralığında bir PCR ürünü elde edecek şekilde primerler tasarlayın. Her seferinde, genomik DNA amplifikasyonu için dört bağımsız reaksiyon ve cDNA amplifikasyonu için dört bağımsız reaksiyon olmak üzere toplam sekiz adet 8 µL'lik PCR reaksiyonu hazırlayın.

PCR reaksiyonu ile ilgili mikro karışım; MLA'nın tack dn, NTP'ler, primerler, magnezyum klorür ve ya genomik DNA ya da cDNA içerir. PCR reaksiyonlarını, döngü sayısını amplifikasyonun lineer fazında tutarak, her primer çifti için optimize edilmiş koşullar altında gerçekleştirin. PCR reaksiyonları tamamlandığında, her PCR ürününe ekzonükleaz bir ve karides alkalin fosfataz (SAP) ekleyip 37 °C'de 20 dakika, ardından 85 °C'de 15 dakika inkübe ederek PCR primerlerini ve fazla dNTP'leri uzaklaştırın.

Her bir PCR ürününü 384 kuyucuklu plakaya ikişer kez damlatın; böylece her örnek için sekiz ölçüm elde edilecektir. Birincil uzama deneyi için toplamda 16 damla oluşturun. Uzama primerini, hem genomik hem de C-D-N-A-P-C-R ürünleri için aynı primerin kullanılabileceği şekilde deney tasarım yazılımı ile tasarlayın.

Primer uzunluğunu 14 ile 18 baz çifti aralığında belirleyin. Birincil uzama reaksiyonunu, üç deoksinükleotid terminatörü ve bir deoksinükleotidin uygun karışımı ile gerçekleştirin. Tipik bir birincil uzama reaksiyonu, 94 °C'de iki dakikalık bir başlangıç adımının ardından; 94 °C'de beş saniye, 52 °C'de beş saniye ve 72 °C'de beş saniyeden oluşan 40 döngüyü içerir.

Son olarak, uzatılmış oligonükleotidler, bir spektro okuyucu kütle spektrometresi kullanılarak matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi ile nicelendirilir. Bu protokolün kilit noktası, artefaktları önlemek için deneysel gürültüyü kontrol etmeye yönelik çeşitli stratejiler kullanmaktır. Deneylerin en az üç kez tekrarlanması oldukça önemlidir.

Deney için en iyi kontrol, primer uzatma için kaplama snip analizinde heterozigot olan ancak hastalıkla ilişkili aleli taşımayan bir hücre hattı kullanmaktır. Ek olarak, alternatif DNA transkribe kodlayan belirteçler için analizler tasarlayın. Bunlar mevcut değilse, primer uzatma analizi için farklı ekzonları hedefleyen alternatif PCR primer çiftleri ile ek bir kontrol sağlanabilir.

İç kontrol, hem ileri hem de geri zincirlere bağlanan uzatma primerlerinin tasarımıyla sağlanabilir. Allele özgü ekspresyon analizine bir örnek, kütle spektrometrisi izleri örnekleriyle burada gösterilmiştir. Bu şekil, dört farklı şablon üzerinde gerçekleştirilen dört allele özgü birincil uzatma ürününün analiz sonuçlarını göstermektedir.

Üstteki iki grafik, her ikisi de transkribe edilen bir kodlama polimorfizmi için heterozigot olan iki farklı hücre hattının genomik DNA analizinden elde edilen sonuçları temsil etmektedir. Ancak, sadece A hücre hattı risk DNA varyansı için heterozigottur. Alttaki bu iki grafik ise, deneysel bir artefakt sonucunda aynı hücre hatlarından üretilen cDNA analizinden elde edilen sonuçları temsil etmektedir.

Genomik analizde bile ilk pik her zaman ikinci pikten daha yüksektir. Bu nedenle, genomik analizden elde edilen sonuçlar cDNA verilerini normalize etmek için kullanılır. İstatistiksel analiz, mass array tipi yazılım kullanılarak tüm ELO tipleme raporunun çıkarılmasıyla gerçekleştirilir.

Bu rapor pik alanına ilişkin veriler sunmaktadır; burada, kodlayan bir snip için heterozigot olan ancak yalnızca hücre A'nın hastalıkla ilişkili bir markör için heterozigot olduğu iki hücre hattı (hücre A ve hücre B) ile ilgili bir örnek gösteriyoruz. Gri renkle belirtilen sütunlar doğrudan yazılım tarafından oluşturulurken, yeşil renkle belirtilen sütunlar her bir hücre için manuel olarak türetilmiştir. Hem cDNA hem de genomik DNA için sekiz ölçüm bulunmaktadır.

Yazılım, iki alelin her birinin bolluğunu temsil eden her spektrum piki altındaki alanı hesaplayacaktır. Alel oranı, her bir cDNA ve genomik örnek için birinci alelin alanının ikinci alelin alanına bölünmesiyle hesaplanır. Sekiz ölçüm üzerinden ortalama ve standart hata hesaplanır.

0,1'den büyük yüksek bir standart hata, ölçümlerin tutarlı olmadığını ve göz ardı edilmesi gerektiğini gösterir. Son olarak, alele özgü ekspresyonda fark olmadığında beklenen bir oran olan bir oranından sapmayı tahmin etmek için cDNA ortalama oranı, genomik DNA ortalama oranı kullanılarak normalize edilir. Normalize edilmiş oran hücre A'da birden farklıyken hücre B'de bire yakındır; bu veriler, hücre hattı A'nın ikinci pik tarafından ölçülen alelle fazda olan ve analiz edilen genin ekspresyonunu azaltan bir DNA varyantı taşıdığını göstermektedir.

Hücre hattı B oldukça uygun bir negatif kontrol sağlar. Bilgilendirici genetik varyantları ve uygun deneysel kontrolleri belirlemek için bu prosedürü uygulamaya çalışmak gerçekten önemlidir. Bu prosedürün yanı sıra, alele özgü gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanılabilecek transkribe edilmiş markörlerin bulunmadığı genetik varyantların nerede olduğu gibi soruları yanıtlamanıza yardımcı olan haplotip spesifik kromatin immünopresipitasyonu gibi diğer yöntemler de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, RNA'nın alele özgü bir şekilde nasıl analiz edileceği ve bunun genetik açıdan önemli fonksiyonel varyantları anlamak için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.