Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hastalıkla ilişkili olanlar gibi belirli bir DNA varyantının, belirli bir genin ekspresyonu üzerinde bir etkisi olup olmadığını test etmektir. Bu işlem, hem söz konusu varyant hem de ilgilenilen gendeki kodlayan bir snip için heterozigot olan hücre hatlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hücrelerden DNA ve RNA ekstrakte edilir ve ardından bunlar allel spesifik primer uzama reaksiyonu için kalıp olarak kullanılır.

Ardından, iki alelin göreceli bolluğunu belirlemek amacıyla birincil uzatma ürünleri kütle spektrometrisi ile analiz edilir. Elde edilen sonuçlar, bir hastalıkla ilişkili olan orijinal DNA varyantının, kütle spektrometrisi ile yapılan kantitatif alele özgü ölçümlere dayanarak gen ekspresyonundaki bir farkla ilişkili olup olmadığını gösterir. Bu tekniğin temel avantajları, lusiferaz raporlayıcı gen analizinin aksine moleküler manipülasyon gerektirmemesi ve gen ekspresyonunun endojen seviyelerini ölçmesidir.

Ayrıca, iki alel arasındaki ekspresyon seviyelerini dahili olarak kontrollü bir şekilde karşılaştırabiliyoruz, bu da deneysel değişkenliğin bir kısmını ortadan kaldırıyor. Bu yöntem, genetik ilişkilerin altında yatan moleküler mekanizmalar gibi insan genetiği alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı oluyor. Bu yöntemin fikrini ilk olarak, üç geni kapsayan bir genetik ilişki tespit ettiğimizde ve sinyali tek bir gene indirgeyemediğimizde geliştirdik.

Daha ileri genetik haritalama yoluyla. Bu analiz için kullanılan hücreler, hem ilgilenilen geni eksprese etmeli hem de iki temel genotipik gereksinimi karşılamalıdır. Bu hücrelerin hem hastalıkla ilişkili DNA dizileri hem de transkriptleri kromozomal kökenlerine göre ayırt edebilen DNA belirteçleri açısından heterozigot olmaları gerekir. Burada gösterilen hücre hattı seçim stratejisinde, A ve B hücre hatları, üçgenlerle temsil edilen transkribe edilen kodlayıcı bir belirteç için heterozigot durumdadır.

Bununla birlikte, Omnicell hattı A, dairelerle temsil edilen ve risk DNA varyantı olarak adlandırılan hastalıkla ilişkili DNA dizisi için heterozigottur. Risk varyantının mavi aleli, daha düşük bir transkripsiyon düzeyi ile ilişkilidir. Tedarikçinin spesifikasyonlarına göre bir flask içindeki hücre hattı kültürünü seçtikten sonra, bu gösterimde fibroblastları kullanacağız. Bu analiz primer hücreler dahil diğer hücre tipleri için de eşit derecede uygulanabilir olsa da, sırasıyla DNA ve RNA ekstraksiyonları için iki adet 10 santimetrelik petri kabı hazırlayın.

Hücreler %80 konfluansa ulaştığında, seçilen hücre tipine uygun olan ticari kitler dahil standart yöntemler kullanılarak DNA ve RNA ekstraksiyonları için hasat edilebilirler. Bu analizi gerçekleştirmeden önce, her bir DNA markörü için iki çift PCR primeri tasarlayın; bir çift genomik DNA amplifikasyonu için, diğeri ise cDNA amplifikasyonu için olmalıdır. Genomik kontaminasyonu önlemek için cDNA amplifikasyonu için kullanılan ileri ve geri primerleri farklı eksonlara yerleştirin. Her hücre hattı için 100 ile 500 baz çifti uzunluğunda bir PCR ürünü elde edecek primerler tasarlayın. Her seferinde, genomik DNA amplifikasyonu için dört bağımsız reaksiyon ve cDNA amplifikasyonu için dört bağımsız reaksiyon olmak üzere sekiz mikrolitrelik PCR reaksiyonları hazırlayın.

PCR reaksiyonu ile ilgili mikro içerik; MLA'nın tack dn, NTP'ler, primerler, magnezyum klorür ve ya genomik DNA ya da cDNA içerir. PCR reaksiyonlarını, döngü sayısını amplifikasyonun lineer fazında tutarak, her primer çifti için optimize edilmiş koşullar altında gerçekleştirin. PCR reaksiyonları tamamlandığında, her PCR ürününe eksonükleaz bir ve karides alkalin fosfataz (SAP) ekleyip 37 °C'de 20 dakika, ardından 85 °C'de 15 dakika inkübe ederek PCR primerlerini ve fazla dNTP'leri uzaklaştırın.

Her bir PCR ürününü, her örnek için sekiz ölçüm elde edecek şekilde 384 kuyucuklu bir plakaya ikişer kez damlatın. Birincil uzama analizi için toplamda 16 damla olacaktır. Uzama primerini, aynı primerin hem genomik hem de C-D-N-A-P-C-R ürünleri için kullanılabileceği şekilde analiz tasarım yazılımı ile tasarlayın.

Primer uzunluğunu 14 ila 18 baz çifti aralığında belirleyin. Birincil uzama reaksiyonunu, üç deoksi nükleotid terminatörü ve bir deoksi nükleotidin uygun karışımıyla gerçekleştirin. Tipik bir birincil uzama reaksiyonu, 94 °C'de iki dakikalık bir başlangıç adımının ardından 94 °C'de beş saniye, 52 °C'de beş saniye ve 72 °C'de beş saniyeden oluşan 40 döngüyü içerir.

Son olarak, uzatılmış oligonükleotidler, bir spektro okuyucu kütle spektrometresi kullanılarak matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi ile nicelendirilir. Bu protokolün kilit bir noktası, artefaktları önlemek için deneysel gürültüyü kontrol etmeye yönelik çeşitli stratejiler kullanmaktır. Deneyi en az üç kez tekrarlamak gerçekten önemlidir.

Deney için en iyi kontrol, primer uzatma için kaplama snip analizine heterozigot olan ancak hastalıkla ilişkili aleli taşımayan bir hücre hattı kullanmaktır. Ayrıca, alternatif DNA transkribe edilen kodlama belirteçleri için analizler tasarlayın. Bunlar mevcut değilse, primer uzatma analizi için farklı eksonları hedefleyen alternatif PCR primer çiftleri ile ek bir kontrol sağlanabilir.

İç kontrol, hem ileri hem de geri zincirlere bağlanan uzatma primerlerinin tasarımıyla sağlanabilir. Allele özgü ekspresyon analizine bir örnek, kütle spektrometrisi izleri örnekleriyle burada gösterilmiştir. Bu şekil, dört farklı şablon üzerinde gerçekleştirilen dört allele özgü primer uzatma ürününün analiz sonuçlarını göstermektedir.

Üstteki iki grafik, her ikisi de transkribe edilen bir kodlama polimorfizmi için heterozigot olan iki farklı hücre hattının genomik DNA analizinden elde edilen sonuçları temsil etmektedir. Ancak, sadece hücre hattı A risk DNA varyansı için heterozigottur. Alttaki bu iki grafik, deneysel artefakt sonucunda aynı hücre hatlarından üretilen cDNA analizinden elde edilen sonuçları temsil etmektedir.

Genomik analizde bile ilk pik her zaman ikinci pikten daha yüksektir. Bu nedenle, genomik analizden elde edilen sonuçlar cDNA verilerini normalize etmek için kullanılır. İstatistiksel analiz, mass array tipi yazılım içerisindeki tüm ELO tipleme raporu çıkarılarak gerçekleştirilir.

Bu rapor pik alanı hakkında veri sunmaktadır; burada, kodlayan bir SNP için heterozigot olan ancak yalnızca hücre A'nın hastalıkla ilişkili bir marker için heterozigot olduğu iki hücre hattına (hücre A ve hücre B) ilişkin bir örneği gösteriyoruz. Gri renkli sütunlar doğrudan yazılım tarafından oluşturulmuşken, yeşil renkli sütunlar her bir hücre için manuel olarak türetilmiştir. Hem cDNA hem de genomik DNA için sekiz ölçüm bulunmaktadır.

Yazılım, iki alelin her birinin bolluğunu temsil eden her spektrum pikinin altındaki alanı hesaplayacaktır. Alel oranı, her bir CDNA ve genomik örnek için birinci alelin alanının ikinci alelin alanına bölünmesiyle hesaplanır. Sekiz ölçüm üzerinden bir ortalama ve standart hata hesaplanır.

0,1'den daha yüksek bir standart hata, ölçümlerin tutarsız olduğunu ve dikkate alınmaması gerektiğini gösterir. Son olarak, allel spesifik ekspresyonda fark olmadığında beklenen bir oran olan bir oranından sapmayı tahmin etmek için, cDNA ortalama oranı genomik DNA ortalama oranı kullanılarak normalize edilir. Normalize edilmiş oran hücre A'da birden farklı, ancak hücre B'de bire yakındır; bu veriler, hücre hattı A'nın, analiz edilen genin ekspresyonunu azaltan ve ikinci pik tarafından ölçülen allel ile fazlanmış bir DNA varyantı taşıdığını göstermektedir.

Hücre hattı B, oldukça kullanışlı bir negatif kontrol sağlar. Bilgilendirici genetik varyantları ve uygun deneysel kontrolleri belirlemek için bu prosedürü uygulamaya çalışmak gerçekten önemlidir. Bu prosedürün ardından, alele özgü gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanılabilecek transkribe edilmiş markörlerin bulunmadığı genetik varyantların nerede olduğu gibi soruları yanıtlamanıza yardımcı olan, haplotip spesifik kromatin immünopresipitasyonu gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, RNA'nın alele özgü bir şekilde nasıl analiz edileceği ve bunun genetik açıdan önemli fonksiyonel varyantları anlamak için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir bilgiye sahip olmalısınız.