Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

Bu prosedürün genel amacı, öğrenme ve hafıza oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemektir. Bal arılarında ilk adım, kovanlarından serbest uçan arıların toplanmasıdır. Ardından, arılar plastik tüplere sabitlenir.

Prosedürün üçüncü adımı, klasik koşullanmanın gerçekleştirilmesidir. Öğrenme ve bellek oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, koşullanma çevresindeki belirli zaman noktalarında ilaçlar enjekte edilebilir. Prosedürün son adımı ise bellek tutulumunu test etmektir.

Nihayetinde, ilaç tedavisinden sonra davranışlarda meydana gelen değişiklikler, bal arılarında öğrenme ve bellek oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilir. Bu yöntem, bellek oluşumunun moleküler mekanizmalarını açığa çıkararak, öğrenme ve bellek alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak araştırmacılar, koşullama ve bellek geri çağırma sırasında uyaranların sunum zamanlamasının kesin olması gerektiği için zorluklar yaşayacaktır. Ayrıca, besleme rejimi kritik önem taşır. Prosedür, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencilere cutting gearing ve Johannes faberg tarafından gösterilecektir. Deneyden bir gün önce, UV ışığı geçirgen bir pleksiglas piramit kullanarak saat 14:00 ile 16:00 arasında arıları toplayın.

Laboratuvara dönüldüğünde, piramidi tabanı üzerine yerleştirin ve tepe noktası açık kalacak şekilde duvarlarını bir havluyla karartın. Tepe noktasını açın ve bir cam tüpü açıklığın üzerine tutarak, kapatmadan önce tek bir arının tüpün içine girmesini sağlayın. Sonbahar ve kış mevsimlerinde tüm arılar bir cam tüpe aktarılana kadar bu prosedüre devam edin.

Arılar dışarıda uçmadığında, bir arı kovanı bir sera içinde ağ içerisinde tutulur ve tekil arılar doğrudan ağdan yakalanır. Arı başına bir cam vial kullanarak, vial buz üzerinde iki buçuk ila üç buçuk dakika soğutularak bir arıyı immobilize edin. Arıyı dikkatlice izleyin ve hareket etmeyi bıraktığı anda buzdan çıkarın.

Hareketsiz hale getirilmiş arıyı küçük bir plastik tüp içinde yapışkan bantla sabitleyin. Arının sadece osis kısmının serbestçe hareket edebildiğinden, ancak baş, toraks veya bacaklarının hareket edemediğinden emin olun. Ayrıca boyun kısmının sıkıştırılmaması da önemlidir.

Bir arı hazırlandığında, daha kolay işlem yapabilmek ve tanımlama sağlamak amacıyla tüpü bir raf üzerindeki numaralandırılmış bir deliğe yerleştirin.

Tüpler her zaman aynı sondaj deliğine geri yerleştirilir. İşlemlerden sonra, arıları koşullandırma alanından farklı bir konumda saat 16:00 ile 18:00 arasında besleyin. Arıların gövdelerine ve antenlerine dokunarak Proboscis extension response veya PER'yi (probosis uzatma yanıtı) tetikleyin.

Bir sükroz çözeltisi ile arının, yaklaşık dört µL'lik bir damla SRA çözeltisi tüketmesini sağlayın. Arının antenlerini, probosisini veya plastik tüpü kirletmediğinizden emin olun. Her arıyı, artık beslenmek istemeyene kadar besleyin.

Antenleri solüsyona değdiğinde hızlı ve güvenilir bir PER gösterin. Deneyin sonraki günlerinde, her arıya bir damla sükroz solüsyonu ile dört kez besleme yapın. Plastik bir kaba yaklaşık 0,5 ila bir santimetre yüksekliğinde musluk suyu doldurun.

Sabitlenmiş arıların bulunduğu rafı, bir lysa plakasını platform olarak kullanarak kasenin içine yerleştirin. Kaseyi kartonla kapatın ve oda sıcaklığında saklayın. Gece boyu bekletin. Arılar, toplandıktan sonraki sabah saat 10:00 civarında koku koşullanmasına tabi tutulur.

Deneyin başlamasından 30 dakika önce. Tasma takılı arıların bulunduğu rafı, koşullandırma alanının yakınına ancak arıların eğitileceği egzoz borusu çıkışından uzağa yerleştirin. Ardından, bir çeker ocak altında çalışarak koşullandırma uyaranını hazırlayın.

Yuvarlak bir filtre kağıdının üzerine filtre uçlu pipet yardımıyla dört µL karanfil yağı damlatın. Kokulu filtre kağıdını 20 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin ve pistonu takın. Deneyciye akustik sinyal verecek olan ses oynatıcısını ayarlayın.

Bu durum; uyaranın, uyaran başlangıcının, uyaran bitişinin, süresinin ve yerleştirilmesinin hassas zamanlamasını sağlar. Koşullama boyunca arının davranışlarını kaydetmek için hazırlık yapın. Arı, koşullu uyaranın başlangıcı ile koşulsuz uyaranın sunulması arasında SSIS'ini uzatırsa pozitif bir puan verilir.

Açık mandibulalar arasındaki sanal bir çizgiyi geçmek için, bir edinim denemesini başlatmak üzere eğitilecek arıyı seçin ve egzozun önüne 10 saniye boyunca yerleştirin. Bu on saniyelik aralığın bitiminden kısa bir süre önce, koku içeren şırıngayı arının antenlerinden üç santimetre uzağa yerleştirin. Şırıngadan 20 mililitre hava iterek kokuyu beş saniye boyunca sunun.

Üç saniye sonra, bir antenin distal flagellumunun ventral kısmına nemli bir kürdan yardımıyla sukroz çözeltisi dokundurularak koşulsuz uyaran verilir. Çözeltinin arıların ve antenlerin üzerine dökülmemesine dikkat edilerek, arının kürdanı yalamasına izin verilir. Bu bileşik uyaran dört saniye sürer ve ardından arılar eğitim ortamından çıkarılarak tekrar rafa yerleştirilir.

Koşullandırıcı uyaranın sunumundan 13 saniye sonra, bir eğitim denemesi 28 saniye sürer. 10 dakikalık bir denemeler arası aradan sonra arıyı eğitim alanına geri götürün. Üç denemenin ikincisini daha önce gösterildiği şekilde gerçekleştirin ve son eşleştirme işlemini yapmadan önce 10 dakika daha bekleyin.

Günün eğitimi tamamlandıktan sonra, rafları tekrar kaba yerleştirin. Saat 16:00 ile 18:00 arasında her arıya birer tane 4 µL sakkaroz çözeltisi damlası ile dört kez besleme yapmayı unutmayın. Daha önce gösterildiği gibi, tutma testleri eğitimden sonra dakikalar ile günler arasında herhangi bir aralıkta gerçekleştirilebilir. Arı rafını 30 dakika boyunca koşullandırma alanının yakınına yerleştirerek hafıza testi için hazırlık yapın.

Bir arıyı egzozun önüne 10 saniye boyunca yerleştirerek testi başlatın. Koşullu uyarıcıyı beş saniye boyunca sunun ve bir PER oluşumunu kaydedin. Günlük test işlemi tamamlandıktan sonra, rafları tekrar kaseye yerleştirin.

Daha önce gösterildiği gibi, her arıyı saat 16:00 ile 18:00 arasında, her seferinde bir adet 4 µL sakkaroz çözeltisi damlası ile dört kez beslemeyi unutmayın; tüm deneyin sonunda, analizlere dahil edilecek olan SRA çözeltisi ile bir antene dokunarak arının probosisini hâlâ uzatabildiğini doğrulayın; arılar tüm deney boyunca hayatta kalmalı ve sağlam bir PER'ye sahip olmalıdır. Bazı çalışmalarda, farmakolojik müdahalelerin koku hafızası üzerindeki etkisini incelemek için sistemik enjeksiyonlar kullanılır. Bu enjeksiyonlar, deneyin tasarımına bağlı olarak farklı zamanlarda uygulanabilir.

Başlamak için, tek kullanımlık bir hipodermik iğne kullanarak S scootin'in arka kısmındaki, uçuş kasının üzerindeki S scootle fissürüne yakın kütikulada küçük bir delik açın. Ardından, bir cam kılcal tüpü test edilecek çözeltiden 1 µL ile doldurun. Kılcal tüpü kütikuladaki deliğe yerleştirin ve çözeltiyi uçuş kasına enjekte edin.

Eğitimli deneyciler, her 30 saniyede bir B enjekte edebilmekte, bu da enjeksiyon ve koşullamanın hassas bir şekilde zamanlanmasına olanak sağlamaktadır. Burada iki deney sunulmuştur. İlk deney, eğitimden önce uygulanan sistemik salin enjeksiyonunun bir anının öğrenilmesi üzerindeki etkisini incelemektedir.

Bu çalışmada üç grup bulunmaktadır: tedavi almayan A grubu, bir mikrolitre sistemik fosfat tamponlu salin enjeksiyonu yapılan grup veya bir şam grubu. Bu tedaviler, burada solda gösterilen eğitimden 30 dakika önce uygulanmıştır. Edinim sırasında koşullu tepki gösteren hayvanların yüzdesi, üç eğitim denemesi boyunca artmış olup gruplar arasında herhangi bir fark görülmemiştir.

Sağdaki sütun grafikleri, ne PBS enjeksiyonunun ne de şam lezyonun hafıza tutulumunu etkilemediğini göstermektedir. İkinci deneydeki eğitimin 24 saat sonrasında, enjeksiyonlar eğitimden 40 dakika sonra yapılmıştır; arılar, bir grubun salin, diğer grubun ise bir mikrolitre protein sentez inhibitörü olan anisomycin aldığı şeklinde ikiye ayrılmıştır. Sağdaki sütun grafikleri, anisomycin alan arılarda hafıza tutulumunda belirgin bir düşüş olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, koku hafızasının oluşumunda protein sentezinin önemini vurgulamaktadır.

Bu prosedürün ardından, öğrenme ve bellek oluşumu gelişiminden sonraki nörofizyolojik temeli nedir gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla elektrofizyolojik kayıtlar yapılabilir. Bu teknik, öğrenme ve bellek araştırmaları alanındaki araştırmacıların, bal arılarında bellek oluşumundaki moleküler ve nörofizyolojik mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açmıştır.