Name: X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin X-ray kristalografi için protein kristalizasyon yöntemlerini. Buhar difüzyonu ve mikro toplu kristalizasyon teknikleriyle yüksek kaliteli protein kristalleri üretmeyi keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma bir Burroughs Wellcome YM Araştırmacı Ödülü ve MD, Yale Üniversitesi&#39;nde Brown-Coxe Doktora Sonrası Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.

Malzemeler: <ul><li> Protein örnek - Lizozim (50 mg / ml) </li><li> Bırak 24-iyi tepsi Asma </li><li> Oturma açılan 24 kuyu tepsisi </li><li> Microbatch kristalizasyon 96 tepsi </li><li> Kristalizasyon çözümler (ya ticari ya da ev yapımı) </li><li> Silikon yağ </li><li> Luer-lock olmadan 5 ml şırınga </li><li> Silikonlu kapak kızakları </li><li> Optik sızdırmazlık bantı </li><li> Parafin </li><li> 0,1-2 mcL mikropipet düşük tutma ipuçları </li><li> Cımbız </li><li> Profesyonel mendil </li></ul> 1. Asma / Bırak Prosedürü oturan: <ol><li> Bir başlangıç ​​ekranı için bir deneme koşulları seyrek matris eksik faktöriyel yöntemi istismar piyasada bulunan ekranlar kullanabilirsiniz. Seyrek matris eksik faktöriyel yöntemi önyargılı ve makromoleküller için bilinen kristalizasyon koşulları (Carter ve Carter, 1979; Cudney ve ark, 1994; Jancarik ve Kim, 1991; Jancarik ve ark, 1991) seçilir. Kristalleşme durumu zaten bilinen ise, orijinal hit etrafında Yağışlı konsantrasyon ve pH değişen dar bir ekran monte edilebilir. En sık başarılı Yağışlı polietilen glikol (PEG), amonyum sülfat. Birlikte, kristalizasyon (Gilliland ve ark, 1994; Kimber ve ark, 2003; Page ve ark, 2003) için kullanılan tüm kaydedilen makromoleküler precipitants yaklaşık% 60 için bu iki precipitants hesap. </li><li> Kristalizasyon çözümler hazırlayın. Genellikle bu koşulları presipite edici bir ajan, bir tür tuz ve pH ayarlamak için bir tampon birleştirilir. Bazı durumlarda katkı için özel ilgi protein eklenebilir. Tüm stok solüsyonu 0.22 mikron filtre kullanılarak filtre edilmelidir. Bazı stok solüsyonu (% 50 PEG, gliserol, PEG-MME, vb) çok viskoz olabilir. <ul><li> 1,5 mL 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 0.1 M NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 ve 4.9 M NaCl (toplam 24 çözümleri) her hazırlayın </li></ul></li><li> Protein örnek çözülme ve buz üzerinde tutmak. Protein hisse senetleri, faiz protein (eğer böyleyse, mağaza, 4 ° C) donma / çözülme duyarlı sürece -80 ° C'de muhafaza edilmelidir. Tipik protein konsantrasyonları yüksek konsantrasyonlarda genellikle daha iyi sonuçlar veren, 5-50 mg / ml aralığında. </li><li> Bazı proteinler kısmi bir çözülme adımdan sonra agrega ve çökelti eğilimindedir - 15min/18, 000xg / 4 ° C örnek Spin. Bu rakamlar, bu nedenle ayrıntılı bir dönüş örnek sadece çözünür moleküller sağlayacak protein molekülleri, geri kalanı amorf yağış teşvik edebilir. Tepsi kadar buz üzerinde protein tutun. </li><li> UV spektrofotometre ile 280 nm dalga boyunda absorbans gelen protein konsantrasyonu belirleyin. Protein konsantrasyonu absorbans okuma ve protein yok katsayısı hesaplanabilir. : Yok katsayısı EXPASY web sitesinde ProtParam aracı ile hesaplanır. <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> 24-iyi asılı / damla tepsi tepsi kurulum şeması (Şekil 2B) göre Yağışlı çözüm 500 mcL oturan kuyu doldurun. Kuyunun kenarında bir silikon gres halka oluşturun. Halka iyi mühürlü olarak hava basıncı oluşumunu önlemek için küçük bir boşluk olmalıdır. Damla oturan, iyi (Şekil 2A) bandı ile mühürlenir beri gres gerek yoktur. </li><li> Bir kapak slayt atın ve yoğun hava spreyi ya da silin profesyonel bir temiz kaçınarak toz kristalizasyon damla yorumlama kolaylığı ve kontaminasyonların ortadan kaldıracaktır. Damla oturma için, kapağını kaydırarak kullanılmaz. Bunun yerine, iyi bir protein ve yağışlı karışık olduğu bir raf bulunur. </li><li> Kapak slayt örnek protein ve rezervuar çözümü eşit miktarda koyun. Farklı miktarda protein ve yağışlı optimizasyon sürecinin parçası olarak denenebilir. Seyreltik protein örneklerinin için arzu edilebilir, ve kristal çekirdeklenme veya büyüme yavaş dengeleme sonra açılan, protein net bir konsantrasyon Yağışlı sonuçlar daha fazla protein kullanılması. Açılan çözümü diğer herhangi bir kalıcı madde de aynı faktör tarafından konsantre olacaktır. Kapak slayt üzerine protein ve rezervuar çözümleri pipetleme, kabarcık oluşumunu önlemek için son derece dikkatli olun. Bu genellikle hava pipetin üflenir oluşur. <ul><li> 0.02 M NaOAc pH 4.9 50 mg / ml lizozim Yük 2 mcL kapak slayt merkezi ve rezervuar çözüm 2 mcL ekleyin: damla Hanging. </li><li> Damla Oturma: Yük 2 raf merkezine 50 mg / ml lizozim çözüm mcL ve rezervuar çözüm 2 mcL ekleyin. </li></ul></li><li> Yavaşça kapağını kaydırarak çevirin ve kuyunun üstüne yağ halkası üzerine uzandı. Pr yağ içinde hafifçe hava yoluyla iyi çentik kaçabilir bastırınolay hava basıncı birikimi ve iyi tutmak iyi mühürlenir. Hava basıncı oluşumunu iyi, iyi mühür ödün, kapağı kaydırın artırabilirsiniz. Oturma bırak yöntemi, optik saydam bant kuyuları kapatmak için kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu yöntem sızdırmazlık, her satır / sütun yer alacak. </li><li> Tepsi tamamlanana kadar bir sonraki iyi geçin. </li><li> Kurulum üzerine tepsisini kontrol edin, toz parçacıkları ve diğer kirlilikler ortadan kaldırarak protein kristalleri yanlış pozitif kimlik azaltabilir. </li><li> Denemenizi belge için bir puanlama tablosu kullanın. </li><li> Genellikle 4 ° C ve oda sıcaklığı arasında, istenen inkübasyon sıcaklığında tepsiye yerleştirin. 20 ° C, en sık başarılı. Tepsi hafifçe ele almak ve herhangi bir sallayarak önlemek için özen gösterin. Inkübatör kapı açılış ve kapanış ederken dikkatli olun. Transfer veya inkübasyon sırasında titreşim veya sıcaklık değişiklikleri, kristal büyümesini önlemek veya kristal kalitesini olumsuz etkileyebilir. Bir şok emici malzeme (örneğin ambalaj köpük) kristal tepsileri altında dolgu olarak kullanılabilir. </li><li> Kristalleri için tepsi ertesi gün kontrol edin ve sonra her birkaç gün, her zaman dikkatli tepsileri taşıma. Bir tepsi özel puanlama sayfasında herhangi bir bulgu ve bırak morfolojileri Belge. Kristalleri bazen çok daha erken (hemen) veya sonra (birkaç ay kadar!) Görünmekle beraber Kristaller genellikle görünür, 2-5 gün sürebilir. Kristalizasyon koşulları tespit edilmiştir ve kristallerin büyüme oranı bilinmektedir sonra kristaller ortaya çıktı ve son boyutu en az yarısının büyüdü kadar, tepsiler rahatsız bırakmak en iyisidir. Tepsileri rahatsız bırakmak, dolayısıyla daha az sayıda daha büyük kristaller üreten, kristal çekirdeklenme olayların sayısını azaltabilir. </li></ol> 2. Prosedür Microbatch: <ol><li> Protein örnek ve yağışlı hazırlık yukarıda açıklandığı gibi. </li><li> Hava püskürtme yeni bir microbatch tepsisi, toz ve diğer büyük parçacıklar önlemek için. </li><li> Microbatch tepsi, 3 mm yüksekliğinde (kuyuları kapsayacak şekilde yeterli) parafin yağı doldurun. Petrol erişimi kaldırın. </li><li> Önceden doldurulmuş, yağ, protein solüsyonu (50 mg / ml lizozim) 1 mcL Yük iyi alt (Şekil 2A) doğrudan çözüm pipetle emin olun. </li><li> Açılan protein damlacık ile, iyi ve sigortalar alt lavabolar emin olun iyi tepsi kurulum şeması (Şekil 2B) göre 1 mcL Yağışlı çözüm yükleyin. </li><li> Tepsi tamamlanana kadar yanında iyi gider. </li><li> Asılı / bırak işlemi oturan 11-14 adımları. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Kristalizasyon, genellikle X-ışını kristalografisi darboğaz olarak adlandırılır. Presipite koşullar seyrek matris eksik faktöriyel ekran genellikle büyük tek kristalleri arasında, protein agregasyonu ve yağış, birçok farklı türde üretir. Protein veya Yağışlı konsantrasyonları çok yüksek bir hiç farklı şekil ve boyut (amorf yağış) ile kahverengi madde görebilirsiniz. Çözüm doymuş olduğunda, açılan genellikle yağış her türlü açık ve tamamen yoksun olacaktır. Şekil 3 yağış olayları ve kristaller (Dessau ve ark, 2006) için çeşitli örnekler gösterir. Daha detaylı yorumlanması ile ilgili daha fazla yağış fenomen <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> adresinde bulunabilir . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Protein kristalizasyon ilkesi. Protein kristalizasyon ilkesi. Buharı difüzyon deneyi (A), yağışlı ve protein eşit hacimlerde açılan bulunmaktadır. Su dışına dağılacaktır ve damla ve rezervuar çözüm arasındaki denge sağlanana kadar yağışlı ve protein konsantrasyonu iki katına çıkarılacaktır. Toplu kristalizasyon (B) Yağışlı ve deney sırasında protein konsantrasyonu değişmez. A Noktası - Protein kristalleri, B noktası oluşmuş olabilir doymuş kalır - Protein çekirdeklenme meydana gelen, kristaller oluşmaya başladı çözüm protein konsantrasyonu ve doygunluk düşer. Nokta C - Protein çökeltileri, ama kristalleri hala büyümek. (C) kullanarak Diyaliz kristalizasyon kapiller jel-takılı. Kristaller tuz jel fiş boyunca (ve / veya Yağışlı yayılır protein örnek içine) protein örnek yayılır gibi görünür. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Anahat tipik bir protein kristalizasyon deneyler. (A), damla buharı difüzyon asılı damla buharı difüzyon oturan ve microbatch protein kristalizasyon Prosedürler. Her iki durumda da, konsantre protein örnek bir küçük hacimli precipitan eşit veya daha küçük hacmi ile karıştırılır.t çözüm ve denge sağlaması için izin. (B), 24-iyi bir tepsi tavuk lizozim kristalizasyon için değişik konsantrasyonlarda sodyum klorür (Yağışlı) ve çeşitli pH tampon olarak 0.1 M sodyum asetat (4.0 - 4.9) ile ayarlanır. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Tipik bir protein kristalizasyon deney sonuçları. (A) Amorf yağış. Protein veya yağışlı (veya her ikisi), yüksek konsantrasyonda olduğu zaman. (B) faz ayrılması. Protein veya deterjan yüksek konsantrasyonda bazı precipitants ile karıştırılarak farklı bir faz için ayrı olabilir. (C) AtCSN7 Rod şekilli protein kristalleri polietilen glikol 8000 ve elde edilen magnezyum asetat (Dessau ve ark, 2006). (D) Lizozim kristallerinin 1.0 M NaCl ve sodyum asetat pH 4.9 aldı. (E) doymuş damla altında genellikle açık kalır. Moşe Dessau Fotoğraf.

<ol><li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization+%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips+%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+%28CSN7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li>
<li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Macromolecule+Crystallization+Database%2C+Version+3.0%3A+new+features%2C+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+matrix+sampling%3A+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li>
<li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+mining+crystallization+databases%3A+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li>
<li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+growth+of+proteins%2C+nucleic+acids%2C+and+viruses+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcPherson%2C+A+%22Crystallization+of+biological+macromolecules%22">Crystallization of biological macromolecules</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics%3A+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li>
</ol>

Bu yazıda, protein kristalizasyon için genel geçerli protokolleri anlatmak ve göstermek. Çok aşamalı bir prosedür bu yana birkaç düşünceler farkında olmak bir ihtiyacı vardır. Buharlaşma nedeniyle açılan kuruma (0.5-2 mcL), çok küçük hacimleri ile çalışırken, büyük bir endişe. Bu nedenle, iyi-kontrollü bir ortamda çalışmak (düşük hava akımı, yüksek nem ve sıkı sıcaklık kontrolü ile) ve açık havaya açılan maruz kalma en aza indiren bir tekniktir benimsemeye tavsiye edilir. Bu nedenle, iyi organize edilmiş bir iş ortamınd...

<table><tbody><tr><td>Lizozim</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 kuyucuklu VDX Plaka</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 kuyucuklu Cryschem Plaka</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning Vakum Gresi</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Silikonize cam daire lamel</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>%100 parafin yağı</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88 inç genişliğinde Crystal Clear Sızdırmazlık Bandı</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 Kuyucuklu Imp@ct Plaka (Mikrobatch plaka)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

x-ray kristalografi protein kristalizasyon

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Nasıl işlediğini anlaması için biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu yapısını kullanarak, modern biyolojinin en önemli alanlarından biridir. Atomik çözünürlükte yapıların durumu derin ve benzersiz bir protein fonksiyonunun anlaşılmasını sağlar ve canlı bir hücrenin iç işleyişini aydınlatmak için yardımcı olur. Bugüne kadar,% 86 Protein Data Bank (rcsb PDB) girişleri makromoleküler yapıları X-ışını kristalografisi kullanılarak belirlenmiştir. Kristalografik çalışmalar için uygun kristaller elde etmek için, makromolekül (örneğin protein, nükleik asit, protein-protein kompleksi ya da protein, nükleik asit kompleksi) homojenlik arıtılmış olmalıdır, ya da mümkün olduğunca yakın homojenliği için. Hazırlık homojenliği (McPherson, 1999 Bergfors, 1999) yüksek çözünürlüklü metodla kristaller elde edilmesinde önemli bir faktördür. Kristalizasyon doygunluk makromolekül getiren gerektirir. Bu nedenle, örnek makromolekül (genellikle 2-50 mg / ml) agregasyonu veya yağış neden olmadan, mümkün olan en yüksek konsantrasyon konsantre olmalıdır. Presipite ajan örnek Tanıtımı çözüm büyüyen büyük üç boyutlu kristaller neden olabilir çözüm, protein kristalleri çekirdeklenme teşvik edebilir. Buharı difüzyon ve toplu kristalizasyon: kristaller elde etmek için iki ana teknikleri vardır. Buharı difüzyon, yağışlı ve protein çözümleri bir karışımını içeren bir damla saf Yağışlı bir odaya kapatılır. Damla ve yağışlı ozmolarite (Şekil 1A) eşit oluncaya kadar su buharı sonra açılan yayılır. Denge sağlanana kadar açılan dehidratasyon faz diyagramı ideal kristal çekirdeklenme bölgesi, hem de protein ve yağışlı yavaş bir konsantrasyon neden olur. Yağışlı (Şekil 1B) uygun miktarda protein ile karıştırma protein tarafından doğrudan çekirdeklenme bölgeye getirerek toplu yöntemi dayanıyor. Bu yöntem genellikle, açılan suyun yayılmasını önlemek için bir parafin / mineral yağ karışımı altında yapılır. Burada yağ altında toplu kristalizasyon ek olarak, damla ve oturma damla asılı buharı difüzyon için deney düzeneği iki türlü gösterecektir.

Kristalleşme genellikle X-ışını kristalografisinin darboğazı olarak adlandırılır. Çöktürücü koşulların seyrek matris eksik faktöriyel taraması, genellikle büyük tek kristaller de dahil olmak üzere birçok farklı protein agregasyonu ve çökelme türü oluşturur. Protein veya çöktürücü konsantrasyonları çok yüksek olduğunda, belirgin bir şekli ve boyutu olmayan kahverengi maddeler (amorf çökelme) görülebilir. Çözelti doygunluk noktasının altında olduğunda, damlacık genellikle tamamen berrak olur ve herhangi bir çökelme görülme...

3-D bir molekül yapısı molekül fonksiyonları nasıl eşsiz bir anlayış sağlar. Yakın atomik çözünürlükte yapı tespiti için temel yöntem, X-ışını kristalografisi. Burada, X-ışını kristalografisi yapı tayini için uygun olan herhangi bir makromolekül üç boyutlu kristaller elde etmek için mevcut yöntemler göstermektedir.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu yapısını kullanarak nasıl işlev gördüklerini anlamak, modern biyolojinin en önemli alanlarından biridir. ...

Bu prosedürün genel amacı, X-ışını kırınımı deneyleri için protein kristalleri üretmektir. Kristal tarama için üç farklı teknik olan, asılı damla (hanging drop) ve oturan damla (sitting drop) yöntemlerini içeren buhar difüzyonu kristalleştirme yöntemlerinin yanı sıra, buhar difüzyonu kristalleştirme için mikro parti (micro batch) kristalleştirme yöntemleri açıklanmaktadır. Kuyucuklar çöktürücü ile doldurulur.Ardından, yüksek konsantrasyonlu saflaştırılmış protein örneği çöktürücü ajanla karıştırılır. Karıştırılan damla daha sonra çöktürücü çözelti içeren bir kuyucuğa yerleştirilerek mühürlenir. Mikro batch kristalizasyonu, kuyucuğun parafin yağı ile doldurulmasıyla başlar.Ardından protein kuyucuklara yüklenir ve bunu çöktürücü çözelti izler. Tüm yöntemlerin son adımı, sistemin dengelenmesini sağlamak ve damlacıklar içindeki kristal oluşumunu ve büyümesini takip etmektir. Nihayetinde, bu teknikle kristaller elde edilebilir ve uygun bir dedektöre sahip bir x-ışını kaynağı kullanılarak protein difraksiyon deseni belirlenebilir.Merhaba, ben Yale Üniversitesi Moleküler Biyofizik ve Biyokimya Bölümü'ndeki Profesör Yoga Motis laboratuvarından Sal. Bugün size saflaştırılmış bir proteinin k

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.

Nötron Makromoleküler Kristalografi için Kristal Büyümesinin Optimizasyonu

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Sunulan protokol, 96 kuyucuklu yüksek verimli bir diyaliz plakası kullanarak protein kristalleşme koşullarını ve kristal büyümesini taramak için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır. Mikrokristallerin büyük ölçekli büyümesi için diyalizör tüplerinin kullanımı, seri kristalografi ve MicroED uygulamaları için de gösterilmiştir.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Bu protokol, 1.536 mikrotahlil plakası hazırlığından 6 haftalık deneysel zaman penceresinin sonuna kadar değişen yüksek verimli kristalizasyon taramasını detaylandırır. Örnek kurulumu, elde edilen görüntüleme ve kullanıcıların makromoleküler kristalleşme koşullarını hızlı ve verimli bir şekilde tanımlamak için yapay zeka özellikli bir grafik kullanıcı arabirimi kullanarak analizleri nasıl gerçekleştirebilecekleri hakkında ayrıntılar dahil edilmiştir.

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Biz non-invaziv 0.7μm piksel çözünürlüğe sahip 3D tomografik veri setleri üretmek için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF) sinkrotron X-ışını tomografisi kullanılır. Volume rendering yazılımı kullanarak, bu histolojik kesit tarafından üretilen eserler olmadan kendi doğal devlet iç yapıları yeniden inşası sağlar.

Sinkrotron-X-ray tomografi Sub-mikron Çözünürlük ile Non-invaziv 3D Görselleştirme

Öğrenin X-ray kristalografi için protein kristalizasyon yöntemlerini. Buhar difüzyonu ve mikro toplu kristalizasyon teknikleriyle yüksek kaliteli protein kristalleri üretmeyi keşfedin.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Daha fazla video keşfet