X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Bu prosedürün genel amacı, burada X-ışını kırınım deneyleri için protein kristalleri üretmektir. Kristal tarama için üç farklı teknik gösterilmiştir: asılı damla ve oturan damla dahil olmak üzere buhar difüzyon kristalizasyon yöntemleri ve ayrıca buhar difüzyon kristalizasyonu için mikro kesikli kristalizasyon yöntemleri açıklanmıştır. Kuyular çökeltici ile doldurulur.

Daha sonra yüksek konsantrasyonda saflaştırılmış protein numunesi, çökeltici ajan ile karıştırılır. Karışık damla daha sonra çökeltici çözeltiyi içeren bir kuyucuk içinde kapatılır. Mikro kesikli kristalizasyon, kuyunun parafin yağı ile doldurulmasıyla başlar.

Protein daha sonra kuyucuklara yüklenir, ardından çökeltici çözelti gelir. Tüm yöntemlerin son adımı, sistemin dengelenmesine izin vermek ve damlaların içindeki kristal görünümünü ve büyümesini takip etmektir. Sonuç olarak, bu teknikten kristaller elde edilebilir ve uygun bir dedektöre sahip bir x-ışını kaynağı kullanılarak protein kırınım modeli belirlenebilir.

Merhaba, ben Sal, Yale Üniversitesi Moleküler Biyofizik ve Biyokimya Bölümü'nde Profesör Yoga Motis'in laboratuvarındanım. Bugün size saflaştırılmış bir proteinin kristalizasyonu için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda viral enfeksiyonun yapısal temelini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım ve biraz kristal yetiştirelim. Tercih edilen bir makromolekül için bir kristalizasyon yöntemini tanımlamak için, ilk ekranlar, deneme koşullarının seyrek matris eksik faktöriyel yönteminden yararlanmak için seçilen, ticari olarak mevcut kristalizasyon çözeltileri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu koşullar, makromoleküller için bilinen ve yaygın olarak başarılı olan kristalleşme koşullarına göre seçilir.

Kristalleşme koşulu bilindikten sonra, orijinal isabet etrafındaki pH'daki çökeltici konsantrasyonunu değiştirerek dar bir elek monte edilebilir. Genellikle bu elekler için kullanılan kristalleşme koşulları, bir çökeltici ajan saldırısı ve pH'ı ayarlamak için bir tampondan oluşur, bu gösteri için tüm stok çözeltilerinin 0.22 mikronluk bir filtreden filtrelenmesi gerekir. Tavuk lizozomu için daha önce tanımlanmış kristalleşme koşulları, çökeltici olarak sodyum klorür ile birlikte kullanılır, çeşitli ph'lerde 0.1 molar sodyum asetat içinde çeşitli konsantrasyonlarda sodyum klorür bir mililitre çözelti hazırlayarak işleme başlar.

Daha sonra çözülür, protein örneği eksi 80 santigrat derecede saklanır ve buz üzerinde tutulur. Tipik protein konsantrasyonları mililitre başına beş ila 50 miligram aralığındadır ve daha yüksek konsantrasyonlarda genellikle daha iyi sonuçlar verir. Burada, 0.02 molar sodyum asetat pH 4.9'da mililitre başına 50 miligramlık bir tavuk yumurtası lizozom çözeltisi kullanılır.

Kısmen toplanmış proteinleri çıkarmak veya çözme adımından çökeltmek için numuneyi 18.000 G ve dört santigrat derecede 15 dakika döndürün. Bu agregalar kristal büyümesine müdahale edebilir ve daha fazla agregasyonu teşvik edebilir. Santrifüjlemeyi takiben.

Bir UV spektrum fotometresi kullanarak 280 nanometredeki absorbansından protein konsantrasyonunu belirleyin. Protein konsantrasyonu, absorbans okumasından ve proteinin yok olma katsayısından hesaplanabilir. Protein numunesi hazır olduğunda, tepsi haritasına göre 24 kuyulu bir oturma damlası kristalizasyon tepsisini 500 mikrolitre çökeltici çözelti ile doldurun.

Halkayı mükemmel bir şekilde kapatmadan her kuyunun kenarında bir silikon yağ halkası oluşturun, böylece hava kuyunun üzerine çıkabilir. Tavan. Tozdan kaçınmak için kapak sürgüsünü yoğunlaştırılmış hava spreyi veya profesyonel bir mendil ile temizleyin, bu da kristalleşme damlalarının yorumlanmasını kolaylaştıracak ve kontaminasyonları ortadan kaldıracaktır. Bir sonraki adım, eşit hacimlerde protein numunesi ve rezervuar solüsyonunu kapak lamına pipetlemektir.

Bununla birlikte, optimizasyon işleminin bir parçası olarak, çökelticiden daha fazla protein kullanılarak farklı hacimlerde protein ve çökeltici denenebilir, bu da dengelenmiş damlada proteinin net bir konsantrasyonu ile sonuçlanır, bu da dute protein numuneleri için arzu edilebilir veya kristal çekirdeklenmesini veya büyümesini yavaşlatır. Bu gösteri için, 0.02 molar sodyum asetat içinde mililitre lizozim başına 50 miligramlık iki mikrolitre. pH dört, kapak sürgüsünün ortasına yüklenir, ardından iki mikrolitre kristalizasyon çözeltisi gelir.

Protein ve rezervuar solüsyonunu kapak kızağına pipetlerken, genellikle pipetten hava üflendiğinde meydana gelen kabarcık oluşumunu önlemek için son derece dikkatli olun. Damladaki yerel olarak yüksek çökeltici konsantrasyonları nedeniyle erken protein çökelmesini önlemeye yardımcı olmak için damlayı nazikçe karıştırın, cımbız kullanarak polietilen glikol gibi viskoz çökeltiler için özellikle önemlidir. Kapak sürgüsünü nazikçe çevirin ve üzerindeki yağ halkasının üzerine yatırın, bunu havanın kuyudan çıkabilmesi için yönlü bir şekilde gerçekleştirin.

Aksi takdirde, hava, kuyu sızdırmazlığını tehlikeye atan kapak sürgüsünü yükseltebilir. Tepsi tamamlanana kadar bir sonraki kuyuya geçin. Tepsi kurulduktan sonra, protein kristallerinin yanlış pozitif tanımlamasını azaltabilecek toz parçacıklarını ve diğer kirleticileri ortadan kaldırarak görsel olarak inceleyin.

Denemeyi belgelemek için bir puan sayfası kullanın. Ardından, tepsiyi genellikle dört santigrat derece ile oda sıcaklığı arasında istenen inkübasyon sıcaklığına yerleştirin. En başarılı sıcaklık 20 santigrat derecedir.

Tepsiyi nazikçe tutmaya ve herhangi bir sallanmayı, titreşimi veya aktarım veya inkübasyon sırasındaki sıcaklık değişikliklerini önlemeye veya kristal kalitesini olumsuz etkilemeye özen gösterin. Ertesi gün ve birkaç günde bir tepside kristal olup olmadığını kontrol edin, tepsileri her zaman dikkatli kullanın. Herhangi bir bulguyu belgeleyin ve morfolojileri bir tepsiye bırakın Özel puanlama sayfası.

Kristallerin ortaya çıkması tipik olarak iki ila beş gün sürer, ancak kristaller bazen neredeyse hemen veya birkaç ay sonra ortaya çıkar. Kristalleşme koşulları belirlendikten ve kristallerin büyüme hızı bilindikten sonra, kristaller ortaya çıkana ve nihai boyutlarının en az yarısına kadar büyüyene kadar tepsileri rahatsız edilmeden bırakmak en iyisidir. Tepsileri rahatsız edilmeden bırakmak, kristal çekirdeklenme olaylarının sayısını azaltabilir, böylece daha az sayıda daha büyük kristalle sonuçlanır Oturma damlası kristalizasyonu için, asılı damla ile aynı prosedürü izleyin, ancak 24 iyi oturan bir damla tepsisi kullanacağız kapak slaytlarının gerekli olmadığı.

Bunun yerine, kuyu, protein ve çökelticinin karıştırıldığı bir raf içerir pipet, mililitre başına 50 miligram iki mikrolitre lizozim çözeltisi rafın ortasına ve hava kabarcıklarının oluşmasını önler. Ardından, tepsi kurulumundan sonra numuneye iki mikrolitre çökeltici çözelti ekleyin. Kuyuları oturma damlası ile optik bantla kapatın.

Kapak kızağı gerekli değildir. Asılı damla için tarif edildiği gibi inkübasyona ve kristal puanlamaya devam edin. Mikro toplu işlem prosedürü gerçekleştirmek için.

Kristalizasyon çözeltisini ve proteini asılı damla prosedürü için tarif edildiği gibi hazırlayın. Mikro parti tepsisinde toz ve diğer büyük parçacıkları önlemek için yeni bir mikro parti tepsisi ve hava spreyi edinin. Her kuyucuğa üç milimetre derinliğe kadar parafin yağı ekleyin.

Ardından fazla yağı alın. Daha sonra, bir mikrolitre protein çözeltisini önceden doldurulmuş kuyucuğa yükleyin ve damlanın kuyunun dibine battığından emin olun. Daha sonra kuyuya bir mikrolitre çökeltici çözelti yükleyin.

Damlanın kuyunun dibine battığından ve protein damlası ile birleştiğinden emin olun. Tepsi tamamlanana kadar bir sonraki kuyucuğa geçin ve burada anlatıldığı gibi inkübasyon ve kristal analizine devam edin. Protein kristalleşmesinin tipik sonuçları.

Deneyler gösterilir. Amorf çökelme, protein ve/veya çökeltici yüksek konsantrasyonda olduğunda meydana gelir. Tersine, doymamış damlalar genellikle berrak kalır.

Faz ayrılması, protein veya deterjan, yüksek konsantrasyonda belirli çökelticilerle karıştırıldığında farklı bir faza ayrılırsa meydana gelebilir. Optimal koşullar altında, protein kristalleri Arabidopsis csn'yi oluşturmalıdır. Polietilen glikol 8.000 ve magnezyum asetatta elde edilen yedi protein kristali çubuk şeklinde görünür.

Gösterilen kristaller ayrıca bir azı dişi, sodyum klorür ve sodyum asetatta elde edilen lizozom protein kristalleridir. pH 4.9'dur. Bu hızlandırılmış film, asılı bırakma yöntemi kullanılırken lizozom kristallerinin kurulumdan sonraki birkaç saat içinde büyük prizmalara dönüştüğünü göstermektedir.

Bu prosedürü yaparken size bir protein deneyinin nasıl kurulacağını gösterdik. Yüksek nem, damla buharlaşmasını en aza indirmeye yardımcı olduğundan, sıcaklık ve nem için sabit kontrol sağlayan bir ortamda çalışmak önemlidir, damlanın açık havaya maruz kalmasını en aza indiren bir teknik benimsemeye çalışın. Bu nedenle, iyi organize edilmiş bir çalışma ortamında çalışmak çok önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.