Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Ben Lindsay Garver ve Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu'nda Dr.George Dimopoulos'un laboratuvarında doktora öğrencisiyim. Ve size bir enjeksiyon tekniği kullanarak RNAi aracılı genlerin susturulmasının nasıl yapıldığını göstereceğim. İlk adım, enjekte edeceğimiz sivrisinekleri toplamak.

Bunlar sadece korkunç bir Gabi. Erkeklerin ve kadınların bir karışımıdır. Bu da bizim akülü aspiratörümüz oldu.

İçinde bir fan var, bu da sivrisinekleri bu nozuldan bu rezervuara çekerek emiş oluşturacak. Bu yüzden fişi çekiyoruz. Sivrisinekleri içeride tutmak için tipik olarak bantlanmış küçük bir erişim kapımız var, ancak onu açıp nozulu yerleştiriyoruz, açıyoruz ve toplamak için kullanıyoruz.

Sivrisinekleri içeri soktuğumuzda, nozulun üstünü tıkıyoruz, rezervuardaki sivrisinekleri görüyoruz. Sonra bu sivrisinekleri uyuşturmak istiyoruz. Bu yüzden bu rezervuarı bir buz kovasına gömüyoruz, üzerini buzla örtüyoruz ve sivrisineklerin aşağı inmesini bekliyoruz.

Tamam, bir sonraki adım Sivrisinekleri enjekte etmek ve bunu kullanmak için, bunu kullanacağız, bu bir nano jet iki. Elimde tutacağım bir asa kısmından oluşuyor. Ve bu, sıvıyı sivrisinek içine dağıtacak olan iğneyi içerecektir.

Doldur ve boşalt düğmelerimize sahip olan ve iğnenin içine ve dışına sıvı çekmekten sorumlu olan kontrol paneli. Ve sonra bu ayaklı. Bu yere konacak.

Ve bunu ayağımla itmek, sivrisineklere uygun hacimden bir damla dağıtacaktır. Bu yüzden sivrisinekler buz üzerindeyken, soğuk bir bloğu sıfır derece ile iki santigrat derece arasında ayarlayarak iş istasyonunu hazırlıyoruz. Bu soğuk blok, daha sonra üzerine monte edilmiş bir cam kızağa sahip olan düz bir ataşmana sahiptir.

Ve bu, biz onları manipüle etmeye çalışırken sivrisineklerin hareket etmesini önleyecektir. Ben de bu cam kılcal iğnelerden birini alacağım. Bu, bir iğne oluşturmak için ısıtılmış ve ortadan çekilmiş normal bir cam kılcal borudur.

Ve bu bizim sıvımızı tutacak olan şeydir. Ve sonra bu sivrisinekleri enjekte etmek ve sıvıyı dağıtmak için kullanacağımız şey. Bu yüzden yapmamız gereken bir sonraki şey, kılcal iğneyi enjeksiyon çubuğumuzun üzerine yerleştirmektir.

Burun parçasını çıkarıyoruz. İç halkaların üreticinizin talimatlarına göre yerleştirildiğinden emin olun. Cam iğneyi burun parçasının içine doğru kaydırın ve kırmamak için ucuna dikkat edin.

Bu sabitlendikten sonra, çubuğun iğnesini kılcal iğneye kaydırın ve burun parçasını sıkıca vidalayın. Bir sonraki şey, kılcal tüpünüzün iğnesinin enjeksiyonlar için iyi bir genişlikte olduğundan emin olmaktır. Bu gerçekten önemli bir noktadır, çünkü çok ince bir iğne doğru miktarda sıvıyı dağıtmaz ve çok kalın bir iğne ucu sivrisinekleri yaralar ve muhtemelen ölüme neden olur.

Bu, çok fazla pratik gerektiren bir şeydir, ancak sivrisineklerinizin uygun şekilde enjekte edilmesi ve hayatta kalması için iyi bir genişlik aslında çok önemlidir. Yaptığım şey, iğnenin ucunu kırmak için ince uçlu forsepslerinizi kullanmak, böylece iğne hala uyumlu ancak stabil olacak. Çift sarmallı RNA örneğimize ihtiyacımız var.

Bu örnek bir kit kullanılarak hazırlanmıştır. Piyasada, ilgilenilen gene özgü çift standart RNA'lar üretebilen çeşitli kitler bulunmaktadır. RNA'larımızı mikrolitre başına üç mikrogram konsantrasyonda kullanıyoruz ve nano enjeksiyon setimiz, bir enjeksiyon 69 nanolitre pozisyonu dağıtacak şekilde ayarladık.

Tüp, iğnemizi sıvının içine soktu ve sıvıyı iğneye çekmek için n çıkarma üzerindeki doldurma düğmesini kullanın. İğnede ihtiyaç duyacağınız sıvı miktarı, enjekte edeceğiniz sivrisinek sayısı ile doğru orantılıdır. Tamam? Ve şimdi sivrisinekleri hazırlamamız gerekiyor.

Bu yüzden plastik P two tabağımızı alıyoruz ve onu buz kovamıza gömüyoruz. Sivrisineklerimizin hareket etmediğini kontrol ediyoruz ve onları soğuk Petri kabına ince bir şekilde yayıyoruz. Bu, çalışırken sivrisineklerin hareket etmemesini ve etrafta uçmamasını sağlar.

Daha sonra sivrisinekleri şu anda sıfır santigrat derecede olan cam kaydırağımıza yerleştiriyoruz. Ve sivrisineklerin konumu, onları nasıl enjekte ettiğimiz konusunda çok önemlidir. Bu yüzden sivrisineklerinizin düzenli bir şekilde sıralanmasını istersiniz, böylece hangilerinin enjekte edildiğini ve hangilerinin enjekte edilmediğini bilirsiniz.

Ayrıca sivrisinekleriniz arasında enjektör ile onlara ulaşabilmeniz için yeterli boşluk olmasını istersiniz. Bu yüzden tek tek sivrisinekleri peewee kabından slayta aktarıyoruz, özen gösteriyoruz, onları bacaklarından tutmaya özen gösteriyoruz. Bu, cesetlerin ezilmesini önler ve daha fazla hayatta kalma ile sonuçlanır.

Yani şimdi enjekte etmeye hazırız. Bir taraftaki sivrisineği desteklemek için ince uçlu forseps kullanıyoruz, ben sağ elini kullanıyorum, bu yüzden bunu sol elimde kullanıyorum. Ve sonra diğer taraftan iğnenin ucunu göğüs kafesinin yan tarafına sokarak enjekte ediyoruz, böylece sivrisineğin göğsü forsepsin uçları ile iğne ucu arasına sıkıştırılır ve iğne noktası girer.

İğne noktası göğüs kafesinin içine girdikten sonra ayak pedalına basın, bir bip sesi duyacaksınız ve sivrisinek göğsüne sıvı dağıtılacaktır. Sonra bir sonrakine geçersiniz ve tekrar edersiniz. Arada bir iğneyi çektiğinizde, giriş bölgesinden çıkan bir damla sıvı göreceksiniz.

Ve bu olursa, sıvının giriş yerine yeniden emilmesini bekleyebilirsiniz. Eğer bu olursa, sorun değil. Damla geri emilmezse, damla göğüs kafesinin dışında kalırsa, o zaman o sivrisinek atılmalı ve siz onun yerine bir tane daha enjekte etmelisiniz.

İğnenizin göğüs kafesine yalnızca gerektiği kadar girdiğinden emin olmanız da önemlidir. Diğer tarafa geçmek veya çok fazla iğne genişliğinin geçmesine izin vermek istemezsiniz. Göğüs veya sivrisinek sağkalımı tehlikeye girecektir.

Bu yüzden bu prosedüre tüm sivrisinekler için gerektiği gibi devam ediyoruz. Bu nedenle, enjekte edilen Sivrisineklerinizi saklamak için, ince bir ağ ile kaplanmış ve bir lastik bant ve bir karton kapakla sabitlenmiş bir bira bardağı karton balmumu kaplı bir kap kullandık. Bantla kaplı erişim kapısını açtık ve sivrisineklerinizin hayatta kalmasına yardımcı olmak için sivrisineklerimizi dikkatlice ekledik.

Buradayken sivrisinekler için bir besin kaynağı görevi gören% 10'luk bir sükroz çözeltisi ile evlendirilmiş bir pamuk topu eklemelisiniz. Ve nemli katlanmış bir kağıt havlu. Yaralı sivrisinekler kuruma eğiliminde olduğundan, bu, nemin korunmasına ve enjekte edilen sivrisineklerin hayatta kalmasına yardımcı olacaktır.

Kağıt havlumuzun ve pamuk toplarımızın ıslak kalması için nemi kontrol altına almak için bunu bir Petri kapağı ile tamamlıyoruz. Ve sonra bunu normal çevre kontrollü koşullar altında kuluçkaya yatırıyoruz. Bu nedenle, RNAi aracılı gen susturmanın moleküler kinetiği, genden gene biraz değişir.

Ve bazı genler için, susturma bir gün içinde gerçekleşebilir ve diğer genler için, etkili susturma birkaç gün boyunca gerçekleşmez. Her gen arasındaki farklar, kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak ölçülebilir ve bu, sivrisineklerinizdeki transkript seviyelerini izleyecek ve etkili susturma elde ettiğinizde size söyleyecektir. Bu yüzden, bu amaç için enjekte ettiğiniz birkaç sivrisineği bir kenara bırakmanızı tavsiye ederim.

Bu aynı zamanda çift sarmallı RNA'larınızın genel olarak ne kadar verimli olduğunu, sizin, belirli çift sarmallı RNA'larınızın verimli susturma sağlayıp sağlayamayacağını belirlemenize yardımcı olacaktır. Ve eğer gerçekten transkript seviyelerine müdahale ediyorsanız, size az önce anomali Gambiya sivrisineklerinin RNAi aracılı Gen susturma prosedürünü gösterdim. Bu prosedür, çift sarmallı RNA'ların Anole Gabi sivrisineklerinin göğüs kafesine mikro enjeksiyonunu içerir.

Bu prosedür önemlidir, çünkü sivrisineklerde bireysel genleri manipüle etmek için en kolay ve en etkili atıklardan biridir.