Name: Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Öğrenin, Anopheles gambiae sivrisineklerinde RNAi aracılığıyla gen susturma yöntemini. Toraks enjeksiyonu tekniğiyle gen fonksiyonlarını ve sıtma vektörü biyolojisini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sivrisinek RNAi-aracılı gen susturulması ilgi gen hedef belirli dsRNAs önceden hazırlanması ve arıtma gerektirir. DsRNA sentezi için, biz bir T7 RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanır Ambion Megascript kitini tavsiye ederiz . DsRNA arıtma için, biz Qiagen RNeasy kitini tavsiye ederiz. DsRNA, Örnekleri sayısal ve 3 mikrogram / mcL su ayarlanmış olmalıdır. Gereksinim duyacağınız diğer malzemeler şunlardır: ince uçlu forseps, cam Slayt, cam microcapillary iğneler, mikroenjektör (Drummond Kullanıcı Nanoject II kullanırız), soğuk bir blok, bir kapalı cam Petri çanak, kağıt havlu ve bir kova buz üstünde monte edilmiş bir ışık mikroskobu . Ayrıca% 10 sakaroz batırılmış pamuk gibi bir besin kaynağı ile birlikte sivrisinek ve onlar için uygun bir kap toplamak için bir yol gerekir. <ol><li> Sivrisinekler toplayın. Pilli bir aspiratör kullanılması, enjekte etmek istediğiniz sivrisinek toplamak. Bir kağıt havlu ya da pamuk sivrisinek yok rezervuar kaçış ve kaldırmak, böylece meme takın. Soğuk havalarda sivrisinek anestezisi bu yana, bir kova buz rezervuar gömmek ve hareket durdurmak için sivrisinekler için 5-10 dakika bekleyin. Anesthetization da soğuk bir oda ya da buzdolabında rezervuara koyarak ya da CO 2 kullanılarak elde edilebilir. Bu 5-10 dakika boyunca, bir sonraki adıma geçin. </li><li> Çalışma alanınızı hazırlamak düz bir yüzeye soğuk blok 2 ° C ve üzerine bir bardak slayt yerleştirmek. Bu onlara enjekte olarak sivrisinek geri kalanı nerede. Mikroenjektör üzerine bir cam iğne takınız ve iğne ucu istenilen genişlikte kırmak için forseps kullanabilir. Genişliği için yeterli sıvı oda makul bir hızda akmasına izin verecek kadar büyük ama enjeksiyon sırasında en az bir yara indirebilmek kadar dar olduğunu önemlidir. İyi bir iğne ucu hafifçe bükülerek dar ama kırılmaz. Istenen çıkış hacmi (RNAi için, biz 69 nL) enjeksiyon ekipmanı ayarlayın. Batmak örnek içine iğne ucu ve iğne üreticinin talimatlarına kullanarak içine sıvı numune. DsRNA çözüm, bakteriyel süspansiyon, ya da diğer sıvı örnek olabilir; enjeksiyon işlemi herkes için aynıdır. Buz kovası bir cam Petri çanak çanak alt tamamen buz iletişime şekilde gömün. Enjekte etmek için hazır olana kadar sivrisinek koyacağız. </li><li> Sivrisinek hazırlayın Transfer 50-100 sivrisinek rezervuar cam Petri kabı. Onları anestezi tutmak için çanak soğuk alt temas emin olun, bunları tek bir katmanda inceltmek için forseps kullanın. Kullanılmadığı zaman kapağı çanak bu sivrisinekler örtün. Sivrisinekler geri kalanı anestezi tutmak için buz kovası rezervuar dönün. </li><li> Sivrisinekler soğuk blok üzerine monte edin. Sivrisinek bir çanak ışık mikroskobu altında, soğuk bir blok üzerine monte edilmiş cam slayt için bir anda transfer etmek için ince uçlu forseps kullanın. Tercihen bacaklar hafifçe vurur taşıyınız. Hat slaytta 30 olarak sivrisinek gibi birçok yan yana mikroenjektör her biri olsun ve her biri soğuk slayt ile temas edinceye emin olun emin olun. Sivrisinek gibi geçinmek ve enjekte henüz hangi biliyorum ki düzenli dizilmiş emin olun. Soğutulmuş Petri kabındaki kapsamındaki diğer sivrisinekler bırakın. </li><li> İlk grup sivrisinek enjekte edilir. Bir elinde ince uçlu uçlu forseps tutun ve bir kalem gibi diğer yandan mikroenjektör tutun. Forseps sivrisinek taşımak için (bacaklar yaralanmayı önlemek için onları idare) ve sivrisinek enjekte olarak sabit tutmak için kullanın. Diğer taraftan enjekte olarak sivrisinek bir tarafı desteklemek için forseps kullanabilir Bu iyi çalışır. Sivrisineğin toraks içine dikkatlice sadece iğne ucu takın. Yaralanmaları en aza indirmek için manikür gergin ama ince bir parçası haline enjekte etmek en iyisidir. Ayrıca, çok derinden enjekte önlemek; toraks içinde sadece ucu istiyorum; derin enjeksiyonlar, hayatta kalma uzlaşma olacak büyük yaralar neden olur. İğnenin ucu konumda, basın ve dsRNA önceden ayarlanan ses getireceği mikroenjektör cihazların ayak pedalı bırakın. Bir veya iki saniye bekleyin ve sivrisinek iğneyi çıkarın. Sıvı yara sitesi dışında bir damla belirirse, bu yaranın içine absorbe edilmesi için birkaç saniye bekleyin. Birkaç saniye içinde absorbe değilse, o sivrisinek atmak ve tekrar deneyin. Cam slayt tüm sivrisinekler için enjeksiyon işlemi devam edin. </li><li> Sivrisinekler Mağaza Bitirdiğinizde, etiketlenmiş, uygun kaplar içine enjekte sivrisinek (1 pint kapsadığı balmumu kaplı karton bardak tercihMesh) netleştirme ve lastik bantlar ve bir karton kapak ile güvenli. </li><li> Tamamlanana kadar enjeksiyonlar devam edin. Slaytta sivrisinek yerleştirmek için devam edin ve sizin arzu örneklem büyüklüğü kadar enjekte bardak transfer . Hesap bazı ölümlerin yeni başlayanlar için çok sivrisinek enjeksiyon travma ölmektedir. Sivrisineklerin neredeyse% 100 enjeksiyon hayatta kadar bu uygulama ile artıracaktır. </li><li> Tamamlandığında, bir gıda kaynağı ile birlikte, fincan katlanmış, ıslak kağıt havlu yerleştirin ve bardak, plastik ambalaj malzemesi ile veya, plastik bir Petri kapak gibi nemi korumak için bir şey kapsayacak. Enjekte sivrisinekler, ıslak havlu ve plastik tarafından tutulan nem bu önlemeye yardımcı olur, böylece kuruma eğilimli. </li><li> Çevre kontrollü bir kuluçka odasında sivrisinek yerleştirin. </li></ol> Not: Verimlilik gen susturulması son derece değişken ve hücreler ve organlar tarafından transkript ve protein ciro oranları ve dsRNA alımı verimliliği de dahil olmak üzere bir takım faktörlere bağlıdır. Biz susturulması, 1 gün sonrası enjeksiyon şeklinde gibi erken başlar bulduk ve 6 gün yazılan enjeksiyon kadar sürebilir. Susturulması doğrulamak için blot gibi kantitatif PCR ve Batı olarak transkript ve protein algılama yöntemleri kullanın. Not: sivrisinek enjeksiyon ve RNAi aracılı gen susturma tekniği birkaç adım çeşitli varyasyonları vardır. Bazı varyasyonlar tarafından açıklanmıştır: Boisson ve ark (2006) ve Blandin ve ark (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

Gen susturma Verim çok değişkendir ve hücreler ve organlar tarafından transkript ve protein ciro oranları ve dsRNA alımı verimliliği de dahil olmak üzere bir takım faktörlere bağlıdır. Biz susturulması gibi erken 1 gün yazılan enjeksiyon başlar ve en fazla 6 gün enjeksiyonu sürebilir bulduk. Susturulması doğrulamak için blot gibi kantitatif PCR ve Batı olarak transkript ve protein algılama yöntemleri kullanın.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td></td><td>dsRNA sentezi için; T7 RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyon reaksiyonu</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>dsRNA saflaştırması için</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>kantifiye edilmeli ve su içerisinde 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L konsantrasyona ayarlanmalıdır</td></tr><tr><td>ince uçlu pens</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lam</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cam mikrokapiler iğneler</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroenjektör</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>ışık mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td><td>soğutma bloğu üzerine monte edilmiş</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td></td><td></td><td></td><td>kapaklı, cam</td></tr><tr><td>kağıt havlular</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%10 sükroz</td><td>gıda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Hayvan</td><td></td><td></td><td>sivrisinekler</td></tr></tbody></table>

yetişkin sivrisinekler (a. gambiae) rnai tahliller için protokol

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Ters genetik yaklaşımlar, sivrisineklerde vektör patojenlere karşı direncin temelinde hangi genlerin yattığını belirlemede son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır. Bu video...

Ben Lindsay Garver, Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu'nda Dr. George Dimopoulos'un laboratuvarında doktora öğrencisiyim. Size, bir enjeksiyon tekniği kullanarak RNAi aracılı gen susturmanın nasıl yapılacağını göstereceğim. İlk adım, enjeksiyon yapacağımız sivrisinekleri toplamaktır.Bunlar sadece stok Gabi'lerdir. Erkek ve dişilerin bir karışımıdır. Ve bu da pille çalışan aspiratörümüzdür.İçerisinde, emiş oluşturarak sivrisinekleri bu nozul aracılığıyla hazneye çeken bir fan bulunmaktadır. Bu yüzden fişi çıkarıyoruz. Genellikle sivrisineklerin içeride kalması için bantlanmış küçük bir erişim kapağımız var; ancak kapağı açıp nozulu yerleştiriyoruz, cihazı çalıştırıyoruz ve toplama işlemi için kullanıyoruz.Sivrisinekleri içeri aldıktan sonra, nozülün üst kısmını tıkarız ve sivrisineklerin rezervuarın içinde olduğunu görürüz. Ardından, bu sivrisinekleri anestezi altına almak isteriz. Bu nedenle, rezervuarı bir buz kovasına gömeriz, üzerini buzla kaplarız ve sivrisineklerin etkisiz hale gelmesini bekleriz.Tamam, bir sonraki adım sivrisineklerin enjeksiyonunu yapmaktır ve bunun için nano jet two kullanacağız. Cihaz, elimde tutacağım bir asa kısmından oluşur. Bu kısım, sıvıyı sivrisineğe v

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, laboratuarda arka Anofel gambiae kullanılan genel teknikler gösterilmektedir. Kan besleme yetişkin için pupa larva organizmanın yaşam döngüsünün tüm aşamalarında laboratuar sivrisinek bakımı için yöntemleri gösterilmektedir.

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

Bu protokolü biz bir ile RNAi-aracılı gen susturulması...

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

RNA-Seq analizleri, model olmayan organizmalarda adaptif özelliklerin moleküler temellerini belirlemek için giderek daha önemli hale geliyor. Burada, diyapoz ve diyapoz olmayan Aedes albopictus sivrisinekleri arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için bir protokol, sivrisinek yetiştiriciliğinden RNA dizilimine ve RNA-Seq verilerinin biyoinformatik analizlerine kadar açıklanmaktadır.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

Sıtma bulaştıran sivrisinekler, yalnızca moleküler teknikler kullanılarak tespit edilebilen epidemiyolojik olarak önemli bir dizi özelliğe sahiptir. MALDI-TOF tabanlı bir SNP genotipleme platformu kullanarak, sıtma vektörlerinin birden fazla temel özelliğini (tür, böcek ilacı direnci, parazit enfeksiyonu ve konakçı seçimi) aynı anda tespit etmek için bir test geliştirdik.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

bipartit GAL4-UAS sistemi, Anopheles gambiae'de fonksiyonel genetik analize izin veren kontrollü bir mekansal şekilde gen ekspresyonunun değiştirilmesi için çok yönlü bir araçtır. Bu sistemi kullanmak için açıklanan prosedürler yarı standart bir klonlama stratejisi, floresan protein belirteçleri ve embriyo fiksasyonu için pupaların cinsiyetlenmesi ve taranmasıdır.

Anopheles gambiae'de Fonksiyonel Genetik için GAL4-UAS Sistemini Kullanma

Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Öğrenin, Anopheles gambiae sivrisineklerinde RNAi aracılığıyla gen susturma yöntemini. Toraks enjeksiyonu tekniğiyle gen fonksiyonlarını ve sıtma vektörü biyolojisini inceleyin.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Daha fazla video keşfet