Name: Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin fare fetüslerine in utero hücre ve virüs nakli yöntemini. Bu teknik kök hücre tedavileri ve gen terapisi uygulamaları için fetal bağışıklık toleransını araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

California Rejeneratif Tıp Klinik Fellow Eğitim Hibe Enstitüsü (AN), Ulusal Bilim Vakfı (MW), Irene Perstein Ödülü (TCM), Amerikan Cerrahlar Koleji (TCM), Amerikan Pediatrik Cerrahi Derneği (finansman kaynakları kabul etmek istiyorum TCM) ve Dimes (TCM) Mart.

1. Enjeksiyon Pipetler hazırlanması <ol><li> Cam pipet ayırma (kalibrasyon ilgili üreticinin talimatlarına bakın) 15 saniye içinde gerçekleşir böyle pipet çektirmenin kalibre edin. Pipet ayıran bir konik olacaktır. </li><li> Pipetin konik başından sonuna kadar mesafe 1.05cm ile 1.04cm böyle pipet sonunda kesin. Pipet uzunluğu pipet orifis kalibre ile ters orantılıdır. Uzun bir pipet verme enjeksiyon sırasında kırılmaya karşı daha duyarlı daha zayıf bir ucu da sonuçları farkında olun. </li><li> Pipet yapımında sonraki adım, bir elmas bileme simidi üzerindeki uç bileme düzgün bir köşe oluşturmak için. Uygun büyüklükte pipet kesme zamanda, pipet, çoğu zaman tekerlek üzerinde pipet verirken kullanılması gerekir, ucunda bir doğal konik kırar. Bu süreçte, hafifçe keskinleştirme tekerlek pipet dinlenme ve pipet hala tekerlek dokunmadan (eğim daha düzgün hale geldikçe, bileme çarkı ile temasa kaybedecek) emin olmak için periyodik olarak yeniden değerlendirmek önemlidir. </li><li> Konik düz sonra, pipet ucu (Şekil 1) bilenmiş olmalıdır. Artık netlik tekerlek dokunmadan olduğu gibi pipet Elevate, 10-50 derece saat yönünde döndürmek ve ~ 10 saniye boyunca dönen bir tekerlek bileme pipet geri koyun. Keskinleştirme tekerlek pipet çekiniz ve şimdi kenarı inceleyeceğiz. Bu adım, genellikle keskin bir kenarı oluşturmak için bazı küçük ayarlamalar ile tekrar edilmesi gerekir. Pipet, çok uzun süre kenarına yerleştirilen ise, pürüzlü bir yüzey (Şekil 1) gelişme olasılığı daha fazladır. Bir tarafında tamamladıktan sonra, yukarıdaki adımları tekrarlayarak karşı kenar netleştirmek için devam edebilirsiniz. </li><li> Her 4mm pipetin konik nerede başlar başlayarak dairesel bir çizgi çizmek için kalıcı bir kalem kullanın. Bu sınır çizgileri hacim 5uL karşılık. </li></ol> 2. Utero Nakli <ol><li> Enjektabl malzeme (örneğin hücreler, virüs, vb.) Hazırladıktan sonra enjeksiyon için ayarlayabilirsiniz. Biz aşağıdaki ayarları ile basınçlı hava bağlı bir mikroenjektör kullanın: (Basınç ayarları: giriş 60-80 psi, 0 psi tutun, 8-12 psi, denge 0 psi enjekte, 40 psi doldurmak; Enjeksiyon süresi 100 milisaniye). </li><li> Enjeksiyon pipet sterilize için, steril 1X PBS ile iki kez izledi% 70 EtOH ile iki kez temizleyin. Pipet ucu çok kırılgan olduğu için, biz enjeksiyon pipetler otoklav önermiyoruz. </li><li> Enjeksiyonlar ya 2.5X 3.5x büyütme loupes veya diseksiyon mikroskobu kullanılarak yapılabilir. Bir ısınma battaniye, aydınlatma ve gerekli cerrahi aletler ile işlem alanı hazırlayın. </li><li> Hamile fare (sürekli bir akış anestezi ünitesi ile teslim izofluran ve oksijen kullanan) anestezisi. Fare fare yere sabitlemek için bant ile her uzuv yatar pozisyona yapıştırınız bir ısıtma yastığı yerleştirin. </li><li> Klip kürk. Daha sonra,% 10 povidon-iyot alkol ile takip ve buprenorfin gibi bir analjezik enjekte hazırlık karın steril cerrahi eldiven giymiş. </li><li> Alt karın (kesi en aşağı yönü introitus yaklaşık 1cm üstün olmalı) 1cm kesi olun. Cilt ve fasya İnsizyon. Hemen altında ince bir tabaka fascia (bağırsak ve mesane) karın içi organların zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Pamuklu çubuk kullanarak, yavaşça fasya esneme ve kesiden gravid rahim sunmak. Fetusların toplam sayısı ilk kez tüm rahim görselleştirmek emin olmak için sağ ve sol yumurtalıklar belirleyerek güvenin. Enjeksiyonlar için hazırlık yaparken fetusların sıcak kalmasını devam etmeden önce karın boşluğuna programlamayı rahim geri yerleştirin. </li><li> Enjekte etmek için planladığınız fetusların sayısı için uygun malzeme hacmi çizin. Iğne örneği ile doldururken, mikroenjektör tüp içine örnek aspire önlemek için pipet Suya daldırılmış tutmak için önemlidir. Parafilm, pipet bozmadan iğne doldurmak için muktedir bir parça ya da doğrudan tüp hücreleri genellikle küçük hacimli olduğu için, biz genellikle küçük bir mikrofuge'ye (0.5mL eski) koyun. </li><li> Her fetusun tutun ve yavaşça enjekte etmek için planladığınız fetus (örneğin karaciğer, peritoneal kavite, bacak, vb) bir parçası belirlemek. Başparmak ve işaret parmağı ile enjeksiyon yapıyorsanız dönmez böylece, amniyotik kavite içinde fetüs stabilize gerekir. Nazikçe yeterince zarar görmesini önlemek için henüz istikrara sıkıca yeterli fetus tutmak için önemlidir. </li><li> Rahim, amniyon ve fetal cilt ile dikkatlice pipet eklemek ve hedef organ. Pipet keskin ise, bu dokular vasıtasıyla kolayca geçmelidir. Pipet mat ise, wi rahim ve amniyotik membranlar haber çadır ll. Istenen birimde her fetüs içine enjekte edilir. Bu hareketleri ekleme, enjeksiyon, pipet çekilmesi ve zamanında kararlı olması zorunludur. </li><li> İstenen hacme enjekte edildikten sonra, pipet dikkatlice geri çekin. Eğer doğru yapılırsa, malzeme amniyotik kavite veya rahim sızıntısı olmamalıdır. Büyük bir delik amniyon, amniyotik sıvı sızıntısı tanıyabilir oluşturulursa, daha sonra hayatta kalma tehlikeye girer. Son olarak, doğum sonrası hasat içeren çalışmalar için, doğumdan sonra enjekte uninjected fetusların ayırt yolu yoktur beri tüm fetusların teknik olarak mükemmel enjeksiyonları almalıdır. </li><li> Fetal karaciğer içine enjeksiyon yapıyorsanız çekilmiş bu sonra, zaman zaman pipet kan görebilirsiniz doğru konumda olduğunu doğruladı ve hayatta kalma etkilememelidir. Intra-peritoneal enjeksiyonlar yerine ise, fetal karaciğer biraz altında hedefliyoruz. Intramüsküler enjeksiyon için, kalça ve femur belirlemek ve gluteus kas enjekte fetus pozisyonu. Son olarak, intraventriküler enjeksiyonları için uygun hedef için pipet doğrudan koronal sütür görmek kolaydır. Bu enjeksiyonlar için, biraz daha büyük kalibreli pipetler, pipet bozmadan kafatası nüfuz gereklidir. </li><li> Sonra, rahim karın boşluğuna geri dikkatlice yerleştirin. Kendisi ya da vasküler kaynağı etrafında bükülmüş değil emin olun. , Işlem sırasında kayboldu herhangi bir sıvı yerine annenin periton boşluğuna steril 1X PBS 1mL sunun. 5-0 örgülü emilebilir sütür (vicryl eski) ile 2 kat kesi kapatın. Öncelikle altta yatan bağırsak veya mesane zarar vermeden fasya kapatmak ve ardından cilde yakın. </li><li> Bu zamanda, post-işlem ilaçlar analjezi için uygulanabilir. Her enjekte kadın kendi bireysel kafesine geri dönün ve bir ısınma battaniye kafes yerleştirin. Dik kadar fare izleyin. Kafes yataklar koyun ve sakin bir bölgede, doğumdan sonra birkaç gün kadar (yani herhangi bir kafes temizlik) rahatsız olmamalıdır fare tesisin fare. Hayvan için herhangi bir ek yük en aza indirmek, erken doğum şansı azalacaktır. </li><li> Enjeksiyonları tamamladıktan sonra, steril 1X PBS ile iki kez pipet temiz ve% 70 kez ile EtOH. </li><li> Enjekte kadın zorlanmadan prosedürü kurtarma sigortalamak için günlük dikkat edilmelidir. Kesi, şişme, enfeksiyon, inflamasyon, yara ayrılması, ve diğer işaretleri takip edilmelidir. Post-operatif analjezikler, gerektiği şekilde uygulanmalıdır. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Survival term doğum enjekte fetusların Bu tekniği ile başarıya ulaşmak için ana sınırlayıcı faktör. Materyal enjekte edilir ve kullanılan fare zorlanma bağlı olarak, sağ kalım oranları değişebilir. Genel olarak, en az% 50 canlı doğan yavrular E14 yabani tip farelere hematopoetik hücre enjeksiyonları sonucu gerekir. Enjeksiyon teknik yönlerinin yanı sıra enjekte olan farelerin özellikleri de bağlı olarak hayatta kalma oranlarının daha yüksek mümkündür. Rahim ve amniyon zarlarına travma en aza indirmek, bu protokolün en önemli teknik yönüdür. Keskin, küçük kalibreli pipetler enjeksiyon sırasında rahim minimal travmaya neden olacaktır. Biz prefabriklerin iğneler kalibreli olarak standart enjeksiyon iğneleri kullanarak çok büyük ve rahim içinde büyük bir delik neden yok. El yapımı cam enjeksiyon pipetler utero enjeksiyonları için kullanılabilir sadece küçük kalibreli iğne. Rahim ve kısa bir anestezi nazik bir kullanım da dahil olmak üzere, dikkatli ve titiz cerrahi teknik, aynı zamanda en iyi sonuçlar için çok önemlidir. Özel alıcı farelerin genetik arka plan, gestasyonel yaş ve çöp boyutu gibi özellikleri de hayatta kalma etkileyebilir. Farelerde bazı suşlarının genetik arka plan bağlı olarak erken doğum ve gebelik kaybı daha duyarlı vajinal orta hat laparotomi geçtikten sonra fetusların teslim yetilerinde olabilir, kas veya nörodejeneratif kusurları ile 15 Transgenik hayvan 8. Bu hamile kadın tarafından teslim gerekebilir Sezaryen. Ayrıca enjeksiyon zamanda gebelik yaşı canlılığı etkisi olduğunu buldular. Embriyonik gün 12 yaşından küçük olan fetuslar eski fetuslara göre daha düşük hayatta kalma oranlarına sahip. Son olarak, büyük çöp boyutları (&gt; 10 fetusların) yüksek enjeksiyon sonrası fetal ölüm oranlarına sahip olma eğiliminde olduğunu buldular. Teknik özellikleri ve bu tekniğin enjekte fetusların yaşam maksimize enjekte edilen farelerin spesifik özellikleri de dikkat etmek. ve_content "&gt; bu yöntemleri doğru bir şekilde yapıldığında, bir bütün fetusların enjekte edilen malzemenin maruz kaldığı bekleyebilirsiniz. postnatal ayarı Benzer, ancak, in utero hücreleri ya da virüsler her zaman başarılı bir şekilde teslim donör hücre engraftman ya da gen sonucu değildir ifadesi, kök hücre engraftman, örneğin, doz ve nakledilen hücrelerin kaynağı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Benzer şekilde, viral transdüksiyon başarısı, kısmen, kullanılan viral vektör tipine göre belirlenir. Bir darbe yavrusunun hayatta kalması, hücresel engraftman, ve viral transdüksiyon bu protokol ile başarıya ulaşmak için çok sayıda faktöre anlamak gerekir. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Diyagramı enjeksiyon pipetler (Adım 1.4) keskinleştirme uygun resmeden

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
<li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28SCIDXI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li>
<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
<li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li>
<li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li>
<li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li>
<li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li>
<li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li>
<li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li>
<li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li>
<li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li>
<li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li>
<li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+at+the+maternal-fetal+interface%3A+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li>
<li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li>
<li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

50 yıl önce, Billingham, Brent ve Medawar yabancı proteinlere karşı bağışıklık indüklenmesidir farelerde utero nakli kullanılır. 16 O zamandan bu yana, bu tekniğin çeşitli varyasyonlar, immünoloji ve kök hücre biyolojisi soruları yanıtlamak için kullanılmaktadır . Burada ayrıntılı protokol IUT için en kolay yöntemlerden biridir. Fetal karaciğer kolayca görüntülenebilmekte bir hedef sunar ve portal ve hepatik ven yoluyla sistemik dolaşıma erişim sağlar. Ancak, istenen enje...

<table><tbody><tr><td>Pipetler</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Pipet sivriltici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

bir fare modeli utero organ nakli

A Mouse Model of in Utero Transplantation

In utero kök hücreler ve virüsler nakli, insan fetus konjenital bozuklukları tedavi etmek için muazzam bir potansiyel vardır . Örneğin, utero hematopoietik kök hücre transplantasyonu (IUT) birçok diğer koşulları ağır kombine immün yetmezlik 1,2 olan hastalarda başarıyla tedavi etmek için kullanılır olmuştur, ancak, IUT başarı olmadan teşebbüs olmuştur. 3 bu karışık sonuçlar göz önüne alındığında , kullanılabilirlik kök hücre nakli ve gen tedavisi biyolojik sekel çalışma için verimli olmayan bir insan modeli bu alanda ilerlemek için kritik öneme sahiptir. Biz ve diğerleri IUT wild-tip farelerden 4-7 ve genetik hastalıklara sahip olanlar başarılı engraftman utero nakledilen hematopoietik kök hücreleri etkileyen faktörleri incelemek için fare modeli kullanmışlardır. 8,9 fetal çevre için önemli avantajlar sunuyor . utero gen tedavisinin başarı. Örneğin, 10 adenoviral teslim 12,13 adeno-ilişkili ceninin içine 11 retroviral, 10, viral ve lentiviral vektörler, uzun vadeli gen ekspresyonu ile enjeksiyon yerinde birden fazla uzak organlara transdüksiyon yol açmıştır. utero Bu nedenle, gen tedavisi, müsküler distrofi veya kistik fibroz gibi tek gen hastalıkları için olası bir tedavi stratejisi olarak kabul edilebilir. IUT potansiyel bir diğer avantajı, belirli bir antijene karşı bağışıklık indüklenmesidir yeteneği. Hemofili, bu protein toleransı erken gelişme sonuçları Faktör IX giriş ile farelerde görülen 14 IUT fare modeli, potansiyel insan tedaviler araştıran kullanımına ek olarak, gelişimsel ve kök hücre biyolojisi temel sorular çalışma için güçlü bir araç olabilir. Örneğin, bir belirlenmiş gebelik aşamasında belirli bir gen ekspresyonunu indükleyen veya inhibe ve gelişimsel yollar işlemek için çeşitli küçük moleküller sunabilirsiniz. Bu değişikliklerin etkisi ilk transplantasyonu sonrası çeşitli timepoints değerlendirilebilir. Ayrıca, fetal ortama ışınlanmamış olmayan ve soğukkanlı bir ana bilgisayar ortamında kök hücre farklılaşması çalışma pluripotent ve soyu özel progenitör hücrelerin nakli. IUT fare modeli zaten immünoloji alanlarında, gelişim ve kök hücre biyolojisi içinde sayısız anlayışlar sağladı. Bu video tabanlı protokol, fare fetuslarda IUT yapmak için bir adım-adım yaklaşım tanımlayan ve kritik adımlar ve bu tekniğin potansiyel tuzaklar anahat.

Fare modeli<em&gt; In utero</em&gt; Transplantasyon fetus kök hücre nakli ve gen tedavisi potansiyel klinik uygulamaları incelemek için kullanılabilir çok yönlü bir araçtır. Bu protokol, biz bu tekniği gerçekleştirmek için genel bir yaklaşım mevcut

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

Kök hücrelerin ve virüslerin in utero transplantasyonu, insan fetüsündeki konjenital bozuklukların tedavisi için muazzam bir potansiyele sahiptir. Örneğin, ...

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin veya virüslerin fare fetüslerine nakledilmesidir. İlk olarak, farenin ventral kısmından bir insizyon yapın. Ardından, uterusu ve fetüsleri dışarı çıkarın ve ardından in utero enjeksiyonları gerçekleştirin.Son olarak, uterusu nazikçe periton boşluğuna geri yerleştirin ve abdominal fasyayı ve cildi kapatın. Nihayetinde, uterus kök hücre transplantasyonu ve gen terapisinde, PCR, akış sitometrisi veya immünohistokimya aracılığıyla hücresel tutunmayı veya gen ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Konjenital bozuklukları doğumdan önce tedavi etmeye yönelik yenilikçi stratejilerimizle, allojenik hücrelere veya protein formlarına tolerans oluşturmak için olgunlaşmamış fetal bağışıklık sisteminden yararlanabiliriz.Utero transplantasyon fare modeli, başarılı greft tutunması ve tolerans indüksiyonuna yol açan fetüse özgü biyolojik faktörleri incelememize olanak tanır. Bu teknik, laboratuvarımdaki bir cerrah ve doktora sonrası araştırmacı olan Amer Nial tarafından gösterilecektir. Enjeksiyon pipetlerinin hazırlanması, pipetin ayrılmasını sağlayacak şekilde kalibre edilmiş bir pipet çekici kullanılarak cam pipetlerin çekilmesiyle başlar.15 saniye içerisinde, pipeti pipet çekiciye yerleştirin ve üst ve alt kıskaçları kullanarak sabitleyin. Ardından çekme düğmesine basın. Filament ısınacak ve pipet ayrılacaktır.Pipetin ayrıldığı noktada bir daralma alanı olacaktır; pipetin ucunu, daralmanın başlangıcından pipetin sonuna kadar olan mesafe 1,04 ile 1,05 santimetre olacak şekilde kesin. Pipetin uzunluğu, pipet ağzının kalibresi ile ters orantılıdır. Daha uzun bir pipet yapılması, enjeksiyon sırasında kırılmaya daha meyilli daha zayıf bir uca yol açacak ve enjekte edilen fare fetüsünün sağkalımını etkileyebilecektir.Pürüzsüz bir eğim oluşturmak için, pipet ucu elmas bir bileme tekerleğinde keskinleştirilmelidir. Tekerleği çalıştırın ve ardından pipeti dönen bileme tekerleğine nazikçe indirin. Pipet ilk kesildiğinde, genellikle doğal bir eğimle kırılacaktır.Uç kısmında, pipetin hala bileme taşına temas ettiğinden emin olmak için ekli mikroskop aracılığıyla pipeti periyodik olarak yeniden değerlendirin. Çünkü pah düzleştikçe, bileme taşıyla olan teması kesilecektir. Pah düzleştiğinde, pipet ucu bilenmelidir.Pipeti, bileme tekerleğine değmeyecek şekilde yukarı kaldırın. Saat yönünde 10 ila 50 derece döndürün ve pipeti yaklaşık 10 saniye boyunca döner bileme tekerleğinin üzerine geri yerleştirin. Pipeti çok uzun süre kenarı üzerine bırakmamaya dikkat edin, aksi takdirde düzensiz bir yüzey oluşabilir.Pipeti bileme taşından çekin ve kenarı inceleyin. Keskin bir kenar oluşturmak için bu adımın genellikle birkaç küçük ayarlama ile tekrarlanması gerekir. Bir tarafı tamamladıktan sonra, karşı kenarı da az önce gösterilen yöntemle aynı şekilde bileyin.Bu diyagram enjeksiyon pipetlerinin doğru şekilde bilenmesini, düzgün bilenmiş bir iğne eğiminin alttan görünümünü ve burada gösterilen, kenarı düzensiz bir pipetin yan görünümünü tasvir etmektedir. Son olarak, çevresel bir çizgi çizmek için kalıcı bir markör kullanın. Pipetin konikleşmeye başladığı noktadan itibaren her dört milimetrede bir yapılan bu işaretlemeler, beş µL hacme karşılık gelir.Enjeksiyonu, pipetleri ve enjekte edilecek materyali hazırladıktan sonra enjeksiyonlar için kurulumu gerçekleştirebilirsiniz. İlk olarak, enjeksiyon pipetinizi bir kez XPBS ile iki defa temizleyin, pipeti PBS içine daldırın ve pipeti dolduracak kadar sıvı aspire edilene kadar doldurma düğmesine basın. Ardından PBS'yi kontrol edin.Ardından, işlem alanınızı bir ısıtıcı battaniye, aydınlatma ve gerekli cerrahi aletler ile hazırlayın. Enjeksiyonlar, 2.5x cerrahi büyütmeli looplar kullanılarak yapılacaktır. Bu gösterimde, bir diseksiyon mikroskobu da kullanılabilse de, anestezili fareyi sırtüstü pozisyonda bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin ve hayvanı sabitlemek için her bir ekstremiteyi bantla tutturun.Tüyler kırpıldıktan sonra, karın bölgesi %10 povidon iyot ve ardından alkol ile hazırlanır; hayvanın tamamen anestezi altında olduğu bir ayak parmağı sıkıştırma testi ile doğrulanır. Ardından alt karın bölgesinde bir santimetrelik bir insizyon yapılır. İnsizyonun en alt kısmı, yaklaşık bir santimetre üstte olacak şekilde deri ve fasya kesilir.İnce fasya tabakasının hemen altında bulunan bağırsaklara ve mesaneye zarar vermemeye dikkat edin. Pamuklu çubuklar kullanarak fasyayı nazikçe gerin ve uterusu insizyondan dışarı çıkarın. Tüm uterusu gözlemlediğinizden emin olmak için sağ ve sol yumurtalıkları tanımlayın ve ardından toplam fetüs sayısını sayın.Enjeksiyonlar için hazırlık yaparken fetüslerin sıcak kalması amacıyla, işleme devam etmeden önce uterusu tekrar abdominal kaviteye yerleştirin. Enjekte edilebilir materyaller genellikle düşük hacimli olduğundan, pipet ucunu kırmadan iğneyi doldurabilmek için bunları genellikle küçük bir mikrofüj tüpüne koyarız. Enjeksiyonlar bu prosedürün en zor aşaması olduğu için, uterusa minimum travma veren iyi bir teknik, bu yöntemin başarısı için kritik öneme sahiptir.Fetüsler sıkıca ancak zarar vermeyecek kadar nazikçe tutulmalıdır. Ayrıca, pipetin yerleştirilmesi ve geri çekilmesi sırasında hareketlerinizin istikrarlı olması zorunludur. Enjekte etmeyi planladığınız fetüs sayısına uygun miktarda materyal çekin.Örneğinizin mikro enjektör tüplerine aspirasyonla çekilmesini önlemek için pipet uçlarını mers ile tutmak önemlidir. Bir fetüsü nazikçe tutun ve enjeksiyon yapmayı planladığınız bölgeyi belirleyin. Bu gösterimde, her bir fetüsün farklı bir vücut bölgesine enjeksiyon yapacağız; ilk bölge fetal karaciğer olacaktır.Enjeksiyonu gerçekleştirirken fetüsün dönmesini önlemek için başparmağınız ve işaret parmağınızla onu amniyotik boşluk içerisinde sabitleyin. Karaciğere enjeksiyon yapmak için pipeti uterus, amniyon ve fetal deri üzerinden dikkatlice geçirerek fetal karaciğere yerleştirin. Keskin bir pipet bu dokulardan kolayca geçmelidir.İstenen hacmi fetüse enjekte edin ve pipeti yavaşça geri çekin. İntraperitoneal enjeksiyonlar sırasında pipetin yerleştirilmesi, enjeksiyon ve geri çekilme aşamalarında hareketlerinizin sabit olması zorunludur. Pipet aynı zamanda uterus, amniyon ve fetal deri üzerinden yerleştirilir ancak hafifçe fetal karaciğerin altına yönlendirilir.Kas içi enjeksiyonlar için istenen hacmi enjekte edin. Kalça ve femur bölgelerini belirlemek için fetüsü konumlandırın ve gluteus kasına enjeksiyon yapın. İntraventriküler enjeksiyonlarda, pipeti bu enjeksiyonlar için uygun hedefe yönlendirmek amacıyla koronal sütürleri görmek kolaydır.Pipetin kırılmasını önleyerek kafatasını delebilmek için biraz daha geniş çaplı pipetler gereklidir. Postnatal toplama içeren çalışmalar için, doğumdan sonra enjekte edilen ve edilmeyen fetüsleri ayırt etmenin bir yolu olmadığından, tüm fetüslere teknik olarak kusursuz enjeksiyonlar yapılmalıdır. Enjeksiyonlar uygun şekilde gerçekleştirilirse, amniyotik boşluktan veya uterustan materyal sızmaması gerekir.Fetüslere enjeksiyon yapıldıktan sonra, uterusun kendi üzerine veya vasküler beslenimi etrafında bükülmediğinden emin olarak dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin. İşlem sırasında kaybedilen sıvının yerine konması için annenin periton boşluğuna 1 mL 1X PBS uygulayın. İnsizyonu 5-0 örgü emilebilir sütür ile iki katman halinde kapatın.Öncelikle, altta yer alan bağırsak veya mesaneye zarar vermeden fasyayı kapatın ve ardından cildi kapatın. Son olarak, enjeksiyon yapılan dişiyi kendi bireysel kafesine geri yerleştirin. Kafesi bir ısıtma battaniyesinin üzerine koyun ve kafesin içine altlık yerleştirin.Fareyi, teslimattan birkaç gün sonrasına kadar rahatsız edilmeyeceği, fare tesisinin sessiz bir alanına yerleştirin. Hayvan için ek stres faktörlerinin minimize edilmesi, erken doğum olasılığını azaltacaktır; uterus içi hücresel transplantasyon sonrası donör engraftmanının temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Embriyonik 14. gün fetüslerine GFP pozitif hematopoetik kök hücreler transplant edilmiştir.Donör hücre GFP ekspresyonunu tespit etmek amacıyla, kimera yavruya periferik kan örneklemesi yapılmış ve akış sitometrisi ile donör hücrelerin varlığı doğrulanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, enjeksiyon pipetlerinin nasıl hazırlanacağı ve utero içi enjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Bu temel teknikler ustalaşıldığında.Bu yöntem, temel gelişimsel biyoloji ve kök hücre biyolojisini incelemek amacıyla farklı gestasyonel yaşlardaki fetüslere enjeksiyon yapacak şekilde modifiye edilebilir.

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Fare ve sıçanlarda barsak mezenter arter kaskad rahim dokusundaki otomatik nakli endometriozis cerrahi indüksiyon açıklaması.

Uterus Doku Otomatik nakli Cerrahi indüklenen Endometriozis Fare Modeli

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır.

Fare Modelinde utero-tubal Embriyo Transferi ve Vazektomi

Biz bir rahim içinde nakli (IUT) intravenöz ve içi amniyotik yolları enjeksiyon fare modeli gerçekleştirmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı hücreleri, viral vektörel çizimler ve diğer maddelerin benzersiz bağışıklık dayanıklı fetal ortama tanıtmak için kullanılabilir.

İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli

FEMI'nin yavruların bağırsak sisteminin gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için canlı organizmaların komplikasyonları olmadan anne iltihabına (FEMI) fetal maruziyeti simüle etmek için bir chorioamnionitis modeli geliştirdik. Bu, chorioamnionitis'i takiben bağırsak hasarı gelişimi için mekanistik nedenlerin incelenmesine izin verir.

Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Bu çalışma, endometriozisin klinik olarak anlamlı bir alt tipi olan endometrioma'yı simüle etmek için özel olarak tasarlanmış yeni bir fare modelini tanıtmaktadır. Model, C57BL / 6J farelerini kullanarak, endometrioma ile ilişkili infertilitenin altında yatan patofizyolojik mekanizmaları aydınlatmayı ve üreme tıbbındaki mevcut bilgi boşluğunu kapatmak için rafine bir araç sunmayı amaçlamaktadır.

Endometrioma ile İlgili İnfertiliteyi İncelemek için Deneysel Bir Fare Modelinin Kurulması

Öğrenin fare fetüslerine in utero hücre ve virüs nakli yöntemini. Bu teknik kök hücre tedavileri ve gen terapisi uygulamaları için fetal bağışıklık toleransını araştırır.

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

Daha fazla video keşfet