Name: Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Öğrenin fare embriyolarından organotipik dilim hazırlama yöntemini; GFP ifadesiyle spinal sinir çıkışını gerçek zamanlı görüntüleyin. Bu teknik gelişimsel nörobiyoloji araştırmaları için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar fare embriyoları üzerine 5 dilim kültürü gerçekleştirmek için fikir için özgün kaynak kabul ediyorsunuz. Biz çekimler sırasında bizim Gofer olarak hareket etmek için cömert bilimsel destek ve Anna Degen Joachim Kirsch kabul etmek istiyorum. Heidelberg Üniversitesi (Mükemmellik Küme Hücresel Ağlar): Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.

Bölüm 1: dilimleme ve kültür için hazırlanması. <ol><li> , Orta (DMEM 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 glikoz, 1 mM glutamin, 2,5 mM Hepes, pH 7.3,% 25) ve 3 cm Millicell-CM 0.4 mikron kültür dilimleme 10 cm doku kültürü tabak hazırlayın membran ekler ve 37 ° inkübatör tutmak ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Yaklaşık 37 kalır böylece mikrodalga PBS içinde% 4 düşük erime noktası agaroz Isı ve ısıtma plakası tutmak ° C </li><li> PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8mm KH 2 PO 4) ve buz üzerinde yer 10 cm bakteriyolojik Petri kapları doldurun. </li><li> Mikrotom soğutma cihazı kurun veya tampon tepsisi ve soğutma elemanları öncesi cool dondurucuda saklanan sağlamak. </li></ol> Bölüm 2: Embriyo gömme. <ol><li> Embriyolar rahim inceleyin ve GFP ifade kontrol etmek için ters bir floresan mikroskop ile incelenmesi. </li><li> 10 cm ters bir Petri kabı ve yönlendirmek onları yerleştirin embriyolar whatman kağıt şeritleri kullanarak aşırı PBS kaldırmak için. </li><li> Bu pozisyonda onu düzeltmek için embriyo üzerinde agaroz uygulayın. Agaroz katılaşmaya. </li><li> Bir jiletle keserek embriyo çevreleyen alanı sınırlayın. </li><li> Diğer yüzüne gömülü embriyo döndürün. </li><li> Embriyo tamamen gömülü olduğundan emin olmak için ek agaroz embriyonik doku uygulayın. </li><li> Loctite 406, "Krazy Glue" 'e benzer özel bir tutkal kullanarak vibratome Chuck temiz kenarlar ve montaj agaroz blok hazırlayın. </li></ol> Bölüm 3: prosedürü Dilimleme. <ol><li> Precooled tampon tepsisi ve soğutma elemanı ayarlayın. </li><li> Yapıştırılmış dokusu ile mandreni takın ve 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 + ücretsiz HBSS, 10 mM HEPES tamponu pH 7.3, 500 U / ml penisilin / streptomisin) kadar kapalı. </li><li> Yerleştirin ve bir precleaned (70% Etanol) mikrotom bıçak düzeltmek. </li><li> 350 - 450 mikron dilimleri hazırlayın ve onları kısaltılmış cam pasteur pipetler doku kültürü plakaları ile transfer buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> Bir çift forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir dilim ve kültür membranlar Millicell transfer agaroz kaldırmak. Yaklaşık 4 dilim 6 ml kültür ortamı ile dolu bir 10 cm doku kültürü plakası bir membran üzerinde yetiştirilebilir. </li><li> 37 ° dilimleri ° C'de ve% 5 CO 2 (orta Kültür: DMEM,% 25 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 'lik glukoz, 1mm glutamin, 2.5 mM HEPES, pH 7.3). Bir zaman atlamalı görüntüleme serisi gerçekleştirir ise bir orta hacmi sabit tutmak gerekir. Zamanlı görüntüleme serisinin kısa bir zaman diliminde durumda olduğu gibi, orta bırakmak için yeterli. Uzun kültür dönemleri değişiklikler için 12-20 saat sonra tavsiye edilir. </li></ol> Bölüm 4: mikroskop Görüntüleme spinal sinir sonucudur. <ol><li> Spinal sinirler dik bir floresan mikroskop altında dilimleri, Millicell kültür membranlar içeren, 10 cm doku kültürü plakası yerleştirerek. </li><li> Sonraki görüntüleme süresi noktası sırasında mikroskop sahnede Millicell kültür membranlar yönünü doğru biçimde konumlandırmak için etiketleyin. </li><li> Resim spinal sinir akıbet 4x (sayısal diyafram [NA] 0.1), 10x (NA 0.3), veya 20x (NA 0.5) amaçlar. </li></ol> Şekil 1, 4x ve 10x hedefleri ile 20 saat boyunca kültür spinal sinir akıbet resmeden bir görüntüleme serisi gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Görüntüleme serisi homozigot tauGPF embriyo enine bir dilim spinal sinir akıbet. * = Motor nöronlar ventral omurilik, ok = DRG. Dilim (D) dorsal-ventral (V) eksen gösterilir. Scalebars: 200 mm.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

Gebeliğin orta fare embriyoları embriyonik dilim kültürleri (E10 - E12) hazırlamak için kapsamlı bir yöntem karşılaştırıldığında, biz bir vibratome soru kültürlerin genel uygulanabilirliği ve tekrarlanabilirliği hem açısından en güvenilir sonuçlar verdiğini gözlemledik sinir akıbet desenler. Buna karşılık, dilimler 3 tamamen inviable olduğunu kanıtladı McIlwain doku kıyıcı kullanılarak hazırlanmıştır. Biz aslında tüm embriyoların bir çöp eş zamanlı seri üretmek için 400 mikron bölüm 1 rendeleyin bi...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon aletleri</td><td>Fine Science Tools</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>L.M.P. agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Kısaltılmış ateşle cilalanmış pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM insertler</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>10 cm kültür plakaları</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Jiletler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>x4 objektif</td><td>Olympus Corporation</td><td>PL serisi</td><td></td></tr><tr><td>x10 objektif</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFL &amp;#8211;PH serisi</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı hazne ekipmanı</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 ve inkübatör S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

organotipik dilim kültür gfp-periferik sinir akıbet gerçek zamanlı görüntüleme fare embriyolar ifade

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Birçok amaç için, fare embriyoları ex vivo Organotipik dilimleri olarak ekimi arzu edilir. Örneğin, biz, hem filmin innervasyon imkanı sağlayan, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş bir versiyonu sadece gelişmekte olan santral ve periferal sinir sistemi 1 bütün nöronlar ifade edildiği bir transgenik fare hattı (tauGFP) istihdam farmakolojik ve genetik teknikleri ile 2 ön ayakları ve bu süreci yönetmek için. Böyle bir dilim kültürlerin başarılı yetiştiriciliğinde en kritik parametre dilimleri tarafından hazırlanan bir yöntemdir. Çeşitli yöntemler geniş test ettikten sonra, bir vibratome, onlar, birkaç günlük bir süre içinde canlılığını ve en önemlisi gösteren bir kültür rutin Sonuç olarak bu tür embriyoların dilim mümkün olan en iyi cihaz olduğunu bulduk, bir yaş gelişir özel bir şekilde. Gebeliğin orta embriyolar için, bu, omurilik ve dorsal kök gangliyon, çevre ve iskelet ve kas dokusu uygun belirlenmesi hedeflerine spinal sinirlerin normal akıbet içerir. 400 mikrometre dilim dilim hazırlandıktan sonra iki gün için çalışılan bir standart doku kültürü inkübatör, tarım için - Bu çalışmada, 300 içine (E) E10 E12 embriyonik gün bütün embriyolar işlenmesi için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşımın başarısı için kritik her agaroz gömülü embriyo dilim vibratome kullanılmasıdır. Bu bir arayüz kültür tekniği ile sonuçlanan orta küçük bir hacim üzerine yerleştirilen Millicell kültür membran ekler, üzerine dilim ekimi tarafından takip edilmektedir. 7 embriyoların ortalama bir çöp rutin nedeniyle embriyoların yaşın yanı sıra dilimlerin kalınlığı biraz değişir en az 14 dilim (2-3 dilim embriyo başına ön ayakları bölgenin), üretir. Kültürlü dilim yaklaşık% 80&#39;i, tüm kültür süresi 2 boyunca ölçülen sinir akıbet göstermektedir. TauGFP fare satırını kullanarak Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir.

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Birçok amaç için, fare embriyolarının ex vivo olarak organotipik kesitler şeklinde kültüre edilmesi istenir. Örneğin, ... içerisinde transgenik bir fare hattı (tauGFP) kullanmaktayız.

Bu prosedürün genel amacı, spinal sinir çıkışını görüntülemek için GFP eksprese eden fare embriyolarının ön kol bölgesinden organotipik transvers kesitler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle embriyoların düşük erime noktalı aros içine gömülmesi ve doku ile aros alanının ilgi duyulan bölgeyle sınırlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kesit alma işlemi için aros bloğu monte edilir.Ardından, blok içine gömülmüş embriyolar vibratör ile dilimlenir. Prosedürün son adımı, dilimleri çevreleyen agarın çıkarılması ve dilimlerin kültür plaklarına aktarılmasıdır. Dilimler daha sonra kültüre edilir ve periferiye doğru periferik sinirlerin uzandığı gözlemlenir; bu süreç floresan mikroskobu ile takip edilebilir.Bu tekniğin giyotin veya doku doğrayıcı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kesitlerin daha kontrollü bir şekilde oluşturulması ve kültürde daha yüksek canlılık göstermesidir. Bu nedenle, bu yöntem; spinal sinirlerin yönelimi ve uzaması gibi gelişimsel nörobiyoloji çalışmalarına yardımcı olabilir, prosedürü Isabel barman gösterecektir. Bu prosedüre, 10 santimetrelik doku kültürü plaklarını altı mililitre kültür ortamı ve üç santimetrelik milli cell cm, 0,4 mikron kültür membr

organotypic-slice-culture-gfp-expressing-mouse-embryos-for-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Bu video, transgenik fare embriyolarından alınan okülomotor dilimlerin ex vivo kültürünü ve görüntülemesini göstermektedir. Embriyolar izole edilir ve agaroza gömülür. Bir vibratom kullanılarak, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimler elde edilir. Dilimler kültürde tutulur ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir.

Transgenik Fare Embriyolarından Okülomotor Kesitlerin Ex Vivo Kültürü ve Görüntülenmesi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin fare embriyolarından organotipik dilim hazırlama yöntemini; GFP ifadesiyle spinal sinir çıkışını gerçek zamanlı görüntüleyin. Bu teknik gelişimsel nörobiyoloji araştırmaları için değerli bir araç sunar.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Daha fazla video keşfet