Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Bu prosedürün genel amacı, spinal sinir çıkışını görüntülemek için GFP eksprese eden fare embriyolarının ön uzuv bölgesinden organotipik transvers kesitler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle embriyoların düşük erime noktalı aros içine gömülmesi ve doku ile aros alanının ilgili bölgeyle sınırlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra aros bloğu, dilimleme işlemi için monte edilir.

Ardından, blok içerisine gömülmüş embriyolar vibratör ile dilimlenir. Prosedürün son adımı, dilimleri çevreleyen agarosun uzaklaştırılması ve dilimlerin kültür plaklarına aktarılmasıdır. Dilimler daha sonra kültüre edilir ve periferik sinirlerin çevreye doğru büyüme gösterdiği gözlemlenir; bu süreç floresan mikroskobu ile takip edilebilir.

Bu tekniğin giyotin veya doku kıyıcısı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dilimlerin daha kontrollü bir şekilde oluşturulması ve kültürde daha iyi canlılık göstermesidir. Bu nedenle, bu yöntem, spinal sinirlerin kılavuzluğu ve uzaması gibi gelişimsel nörobiyoloji çalışmalarına yardımcı olabilir; prosedürün gösterimini Isabel barman yapacaktır. Bu prosedüre, 10 santimetrelik doku kültürü plaklarını altı mililitre kültür medyumu ile ve üç santimetrelik milli cell cm, 0,4 mikron kültür membran insertlerini hazırlayarak başlayın.

Bunları 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde tutun. Ardından, PBS içindeki %4 düşük erime noktalı agarı mikrodalgada ısıtın ve yaklaşık 37 °C'de kalması için bir ısıtıcı plaka üzerinde tutun. 10 cm'lik bakteriyolojik Petri kaplarını PBS ile doldurun ve buz üzerine yerleştirin.

Ardından Viome soğutma cihazını kurun. Embriyoları gömmek için tampon tepsisini ve soğutma elemanlarını tamamen donana kadar dondurucuda saklayın. İlk olarak embriyoları uterustan çıkarın.

Bunları ters floresan mikroskobu ile inceleyin ve GFP ekspresyonunu kontrol edin. Ardından, embriyoları yönlendirmek için watman kağıdı şeritleri kullanarak 10 santimetrelik ters bir Petri kabına yerleştirin ve fazla PBS'yi uzaklaştırın. Embriyoyu sabitlemek için üzerine aros uygulayın.

Yönlendirilmiş konumda, arosun katılaşmasını bekleyin; fazla arosu ve istenirse embriyonun orta kısmını çevreleyen dokuları temizleyin. Gömülü embriyoyu diğer yanına döndürün. Embriyonun tamamen gömüldüğünden emin olmak için embriyonik doku üzerine ek aros uygulayın.

Arosun katılaşmasını bekleyin. Kenarları temiz, embriyo gömülü aros bloğunu hazırlayın. Son olarak, numuneyi Loctite 4 0 6 ile bir viome mandrenine yapıştırın.

Önceden soğutulmuş tampon tepsisini ve soğutma elemanlarını hazırlayın. Yapıştırılmış dokunun bulunduğu mandreni viome üzerine yerleştirin. Doku tamamen kaplanana kadar mandrene bir adet X-H-B-S-S ekleyin.

Bıçak tutucusuna önceden temizlenmiş bir viome bıçağı yerleştirin. Ardından, yaklaşık 350 ila 450 mikron kalınlığında transvers kesitler hazırlayın. Her bir kesit, bir HM six 50 V mikrotom kullanılarak kesilir.

Kesitleri, kısaltılmış bir cam pastör pipeti ile doku kültürü plaklarına aktarın ve buz üzerinde tutun. Bir pens yardımıyla, tüm kesitlerdeki tüyleri dikkatlice temizleyin. Ardından kesitleri, her bir membran üzerine dört kesit gelecek şekilde, 6 mL ön ısıtmalı kültür ortamı ile doldurulmuş 10 cm'lik kültür plaklarındaki milisel hücre kültürü membranlarına aktarın.

Kesitleri, time-lapse görüntülemenin başlangıcına kadar ve görüntüleme aralıkları arasında 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Kesitlerin bulunduğu Millicell hücre kültürü membranlarını içeren doku kültürü plağını dik bir floresan mikroskobun altına yerleştirin ve spinal sinirleri bulun; spinal sinir uzamasını 4x, 10x veya 20x objektifler kullanarak görüntüleyin. Sıcaklık ve karbondioksit stabilizasyonunun sağlanamadığı durumlar için, bir sonraki görüntüleme zaman noktasında doğru şekilde yeniden konumlandırmak amacıyla mikroskop tablasındaki Millicell hücre kültürü membranlarının yönünü işaretleyin.

Burada gösterilen ortam, homozigot tau GFP embriyosunun transvers kesitinde 24 saatlik kültür süresince spinal sinir uzamasının görüntüleme serisidir. Yıldız, ventral spinal kordun motor nöronlarını ve ok ise DRG'yi belirtmektedir. Üst panel 4 X objektif kullanılarak, alt panel ise 10 x objektif ile görüntülenmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, spinal sinir büyümesini görüntülemek için kullanılabilecek fare embriyolarının organotipik transvers kesitlerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.