Kerevit Bacak ekstansör kas Yüksek ve Düşük Çıkış NMJs Fizyolojik Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, kerevit ekstansör kasında fazik ve tonik motor terminallerin morfolojik boyama ve elektrofizyolojik kayıt ile nasıl açığa çıkarılacağını ve ayırt edileceğini göstermektir. Bu işlem; öncelikle orta büyüklükteki bir kerevitten birinci veya ikinci yürüyüş bacağının koparılması, kütikülün kesilip çıkarılması ve meite segmentindeki fleksör kasın uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Bu işlemler sonucunda ekstansör kas ve sinir demeti açığa çıkar.

Prosedürün ikinci adımı, aksonları ve sinir terminallerini görüntülemek için preparasyonun dört etil amino steril ve metil peritonyum iyodür veya dört D iki asp ile boyanmasıdır. Prosedürün üçüncü adımı, tonik ve/veya fazik nöronların seçici olarak uyarılması ve eş zamanlı olarak kas lifindeki uyarılmış EPSP'lerin hücre içi kayıtlarının yapılmasıdır. Prosedürün son adımı, terminallerden spontan ve uyarılmış qu olaylarını kaydetmek için fokal bir elektrot kullanmaktır.

Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi ve elektrofizyoloji aracılığıyla morfolojik ve fizyolojik olarak tonik ve fazik terminalleri ayıran sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem; kas yorgunluğu, sinaptik depresyon ve sinaptik çapraz etkileşim gibi alanlarda, sinaptik fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Deney, kısyanın kıskaçlarından kaçınacak şekilde dikkatle yakalanmasıyla başlar.

Bacağı, isia pod segmentinden gövdeden ayırın. Isia pod segmentine uygulanan güçlü bir sıkıştırma, kerevitin ilk yürüyüş bacağını otomize etmesini veya doğal olarak koparmasını sağlar. Kerevitin kanaması duracaktır ve hayvan tekrar tutma tankına yerleştirilir.

Kerevit kurban edilmez. Kesim işlemleri sırasında hazırlığın kolayca çevrilebilmesi için bacağı bir parça kağıt havlu üzerine yerleştirin. Bacağı, dış tarafı yani lateral tarafı diseksiyon plakasına bakana kadar döndürün.

Bu genellikle kavisli tarafı yukarı bakacak şekildedir. Bir skalpel bıçağı kırıcıya takılmış keskin bir jilet kullanarak, şekilde gösterilen deseni takip ederek meite segmentindeki kütikülü aşındırın. Meite carpod eklemi boyunca yapılan dorsalden ventrale doğru olan kesimde, distal yönde çok uzağa gitmemeye dikkat edin.

Bu kesi, alttaki bacak kaslarının üzerinde, meite'de bir pencere oluşturur. Kütikülü şu an için yerinde bırakın. Hazırlığı, kerevit fizyolojik salini içeren bir diseksiyon kabına yerleştirin.

Bu aşamada, ince bir cımbızla carpod segmentinin ortasına ve ischia pod segmentinin dorsal kısmına bir iğne yerleştirin, kütikülde kesilen pencereyi distal uçtan hafifçe kaldırın ve jilet kullanarak fleksör kas liflerini kütikülden ayırın. Distalden proksimale doğru kesmeye devam edin ve son olarak kütikül penceresini kaldırın. Ekstansör kası açığa çıkarmak için, üzerindeki fleksör kas kaldırılmalıdır.

Fleksör kasın tendonunu, bir iğne yardımıyla kas gövdesinden ayırarak serbest bırakın. Ardından tendonu Mari poddy carpod eklemi hizasından kesin. Gösterildiği gibi, kesme işlemini gerçekleştirmeden önce tendonu bacak boşluğundan uzaklaştırmaya çok dikkat edin ve tendonun iç tarafında bulunan ana bacak sinirini değil, yalnızca tendonu kestiğinizden emin olun.

Kesenin olduğu yerdeki tendonu cımbızla sıkıştırın ve fleksör kası, yukarı doğru kaldırarak bacadan ayırın. Ekstansör kasa giden siniri açığa çıkarmak için, ana bacak sinirini merepod karpod ekleminden kesin ve ana bacak sinirini dikkatlice ekstansör kasın üzerinden geriye doğru çekin. Ekstansör kasa giden sinirin ana bacak sinirinden ayrılması, ana bacak sinirinin distal kısmının preparasyonun yan tarafına doğru nazikçe çekilmesiyle kolaylaştırılabilir. Ana bacak siniri ekstansör kas üzerinden geriye doğru soyulurken, inhibitör aksonun küçük dallarının kesilmesi gerekebilir.

Sinir demeti, metilen mavisi boyama ile görselleştirilebilir. Ancak, bu üst görüntüdeki elektrofizyolojik kayıtlar için metilen mavisi kullanılmaz. İlgilenilen sinir yolunu işaretlemek için kırmızı oklar kullanılmıştır.

İlgilenilen sinir demeti, merepodun bulunduğu yerin proksimal ucuna yakın, ana bacak sinirinden ayrılan daha büyük demettir. Akson dallanmasına ve sinir içindeki kolayca görülebilen iki aksona dikkat edin. Sinir ve kas açığa çıkarıldığına göre, deneyde kullanılan düzeneği hazırlayın.

İntrasellüler ve ekstrasellüler kayıtlar, standart bir kafa ünitesi ve amplifikatör ile yapılır. Model Axon Clamp 2B amplifikatör ve 1XLU kafa ünitesi kullanmaktayız. Biri intrasellüler ve ikisi ekstrasellüler olmak üzere üç elektrot gereklidir.

İki hücre dışı elektrot, siniri uyarmak ve sinaptik uyarılmış ile spontan olayları kaydetmek için kullanılacaktır. Odaksal elektrotları alevle parlatın ve bir ısıtma elemanı üzerinde hafifçe bükün. Bir odaksal elektrodu salinle doldurduktan sonra, onu uyarıcı elektrot tutucusuna yerleştirin ve uyarıcı telini salinle temas edecek şekilde içeri itin.

Bu düzenek, bir S 88 grass stimülatörüne bağlı olan bir grass P 15 stimülasyon izolasyon ünitesine bağlanmıştır. Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında, aksonları görselleştirmek ve boyamak için D 2 ASP canlı boyası kullanılır; banyo salini, beş mikromolar 4 D 2 ASP boyası içeren salin ile beş dakika boyunca değiştirilir. Beş dakika sonra, kap crayfish fizyolojik salini ile tekrar doldurulur, preparat bir mikroskop altına yerleştirilir ve bir Forex objektifi kullanılır.

10x okülerde, stimülasyon elektrodunu ilgilenilen bölgeye hareket ettirin. Bir sonraki adım, makro patch stimülasyon elektrodunun lümenini fazik veya tonik aksonun üzerine yerleştirmektir. Dört boya ve iki as boya ile boyanmış preparatın bu fotoğrafı, artmış mitokondriyal içerik nedeniyle tonik aksonun daha parlak bir şekilde görüldüğünü göstermektedir.

Floresan mikroskobunda tonik terminaller çok sayıda varisite gösterirken, fazik terminaller daha ince yapıdadır. 20 x objektif ile elektrot, tonik veya fazik aksonun üzerine yerleştirilir. Burada elektrot, tonik akson üzerine yerleştirilmektedir.

Hücre içi elektrodu mikro manipülatörüne yerleştirin, ardından hücre içi elektrodu bir ekstansör kas hücresine yerleştirin. Bu işlem, hücre içi eksitatör postsinaptik potansiyellerin veya EPSP'lerin kaydedilmesi için kullanılacaktır. Kalitatif EPSP kayıtları için.

İkinci odak elektrodunu bir mikromanipülatöre yerleştirin. Bu işlem, önceki hücre içi elektrodun ve tutucunun çıkarılıp yerine temiz bir elektrod tutucusunun yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci odak elektrodunun lümenini doğrudan bir sinaptik varisitenin üzerine getirmek için mikromanipülatörü kullanın.

Elektrot ve sızdırmazlık dirençleri, elektrottan test akım darbeleri geçirilerek belirlenir. Deneylerimizde sızdırmazlık dirençleri 0,3 ile bir mega ohm arasında, elektrot direnci ise 0,5 ile bir mega ohm arasında değişmiştir. Sızdırmazlık direnci, kayıt boyunca izlenebilir.

Stimülasyona başlamaya hazır olduğunuzda, scope 5.0 yazılımını açın ve izole aksonu stimüle etmeye başlayın. Sinir demetinde, tonik akson vakum elektrodu ile stimüle edilir ve kas lifinin EPSP'leri hücre içi veya hücre dışı elektrot ile kaydedilir. EPSP'ler, bir power lab forest arayüzü aracılığıyla bilgisayara kaydedilir.

Tonik akson stimülasyonunun ardından, stimülasyon elektrodu fazik aksona taşınabilir ve sinir stimülasyonunu takiben deney tekrarlanabilir. Hücre içi elektrodu, hem tonik hem de fazik motor nöron aktivitesine yanıt olarak oluşan EPSP'leri kaydeder. Tonik nöromüsküler kavşakların sinaptik kolaylaşması, burada her biri yaklaşık 20 stimülustan oluşan ardışık trenlerin 60 hertz frekansında olduğu gibi, sinir stimülasyonunun frekansına bağlıdır.

Birden fazla uyaranla meydana gelen kolaylaşmaya dikkat edin. Bu şekil, tonik sinirin sırasıyla 20 hertz (mavi), 40 hertz (yeşil) ve 60 hertz (kırmızı) frekanslarda uyarılmasıyla oluşturulan EPSP genliklerini karşılaştırmaktadır; daha yüksek stimülasyon frekanslarında görülen belirgin kolaylaşmaya dikkat edin. Tonik terminallerin sinaptik etkinliği düşüktür, ancak burada gösterilen dramatik kolaylaşmış yanıtlar sergilerler.

Burada önce tek başına tonik EPSP'ler, ardından ise fazik yanıtlar aynı ölçekte üst üste bindirilmiştir. Tonik terminallerin aksine, fazik terminaller yüksek kuantal etkinliğe sahiptir ancak yüksek frekanslı stimülasyonla sinaptik depresyon gösterirler. Fazik terminallerdeki sinaptik depresyon, burada gösterildiği üzere stimülasyon frekansı ile ilişkilidir.

30 dakika boyunca uygulanan sürekli beş hertz stimülasyon, nöromüsküler kavşaktaki yanıtı baskılar. Daha yüksek stimülasyon frekanslarında, uygun stimülasyon ile preparat daha hızlı baskılanacaktır. İstakoz nöromüsküler kavşağı, spike üretmeyen EPSP'ler oluşturur.

Bu EPSP'ler, bu kaslardaki dereceli elektriksel sinyalleri oluşturan kalitatif özellikleri incelemek için kullanılabilir. Burada, tonik terminalin kalitatif sinaptik yanıtları gösterilmiştir. Tüm stimülasyon denemelerinin kalitatif bir olayla sonuçlanmadığına dikkat edin.

Her uyandırılmış yanıt için düşük frekanslı stimülasyon ile kuantal olayların doğrudan sayımı mümkündür. Tonik terminaller için kuantal olayların sayısı kolaylıkla belirlenebilir. Kuantal olaylar sayılarak, fazik motor nöronun sinaptik yanıtları da aynı şekilde kaydedilebilir.

Ancak, uyandırılmış yanıtlar doğaları gereği çok kuantumludur. Ortalama kuantum içeriği, spontan olayların ortalama pik amplitüdü veya alanı ile birlikte sapmaların ortalama amplitüdü veya alanı kullanılarak tahmin edilir. Son bir hatırlatma olarak, ekstansör kası beklerken sinire zarar vermemek için fleksör kası çıkarırken dikkatli olun.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.