Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik membranların elektriksel modeller kullanılarak nasıl anlaşılabileceğini göstermek ve crayfish ventral sinir kordonundan aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesine yönelik prosedürleri ortaya koymaktır. Bu gösterim, ilk olarak membranların elektriksel özelliklerini temsil etmek için bir breadboard üzerindeki devre bileşenlerini kullanır. Prosedürün ikinci adımı, voltaj izleri üzerindeki etkileri görmek için model bir devre üzerindeki direnç ve kapasitansı değiştirmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, model bir devreden öğrenilen kavramların canlı bir sinir preparatına uygulanmasıdır. Prosedürün son adımı ise bileşik aksiyon potansiyellerini kaydetmek ve eşik refrakter dönemleri ile sinaptik iletimin özelliklerini anlamaktır. Sonuç olarak, model bir devrenin bileşenlerinin değiştirilmesi ve canlı sinir uyarımının çeşitlendirilmesiyle gösterildiği üzere, biyolojik membranların elektrik devresi modellerinin ve canlı sinirlerin özelliklerinin incelenmesinin nasıl yararlı öğretim araçları olabileceği ortaya konmuştur.

Bu yöntem, biyolojik membranların elektriksel modeller açısından nasıl anlaşılabileceğine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca kas Görseli gibi diğer dokulara da uygulanabilir. Ventral sinir kordonunun diseksiyonu ve kayıt düzeneğinin kurulması başlangıçta zor olabildiğinden ve sinir kordonundan stimülasyon ve kayıt yapmak için iyi bir düzenek elde etmek adına sinirlerin zarar görmemesi için dikkatli olunması gerektiğinden, bu yöntemin gösterimi kritik öneme sahiptir.

Deneyin ilk bölümünde, sinir hücresi membranının elektriksel aktivitesini simüle etmek için dirençler ve kapasitörler kullanılır. Başlangıç devresi sadece dirençlerden oluşur. Kapasitörler daha sonraki bir adımda eklenir.

Sinir membranının pasif direnç özellikleri burada gösterilen devre ile temsil edilmektedir. Breadboard, transvers membran direncini temsil eden 33 kilo ohm'luk paralel dirençler ve hücre içi direnci temsil eden 10 kilo ohm'luk seri dirençlerle kurulmuştur. Bu devre, dış sıvının direncinin, hücre içi ve transvers membran dirençlerine kıyasla ihmal edilebilir olduğunu varsayar.

Model hücreniz tamamlandığında, güç laboratuvarının çıkış kablolarını breadboard modeline bağlayın. Güç laboratuvarı stimülasyonu oluşturur ve voltaj kaydı için bir ölçüm probuna sahiptir. Ardından, güç laboratuvarını bilgisayara bağlayın.

Bilgisayar, breadboard'dan kaydedilen elektriksel sinyalleri görüntülemek için kullanılır. Bir sonraki adım, PowerLab tarafından model sinir hücresine gönderilen uyarıyı kontrol edecek bilgisayar yazılımını kurmaktır. Masaüstündeki LabChart programını açın.

Yeni dosya seçeneğini, ardından kurulumu ve kanal ayarlarını seçin. Görüntülenecek bir kanal seçin, ardından stimülatör panelini seçin. 1.5 voltluk uzun darbeler gereklidir.

Deneyin bu bölümü için genliği bir volt olarak ayarlayın. Power lab, pozitif ve negatif 0.5 volt arasında dalgalanan bir voltaj yayacaktır ve bu da bir voltluk bir tepe uyarımıyla sonuçlanacaktır. Frekansı 0.75 hertz ve pals süresini bir saniye olarak ayarlayın.

Kanal ayarları için, izlenecek olan birinci kanalı seçin, giriş amplifikatörüne tıklayın ve kutucuktaki diferansiyel düğmesine tıklayarak aralığı beş bolt olarak ayarlayıp seçin. Tamam. Bir sonraki adım, sinir hücresi modeline elektriksel bir sinyal uygulamak ve sinyalin model boyunca meydana gelen kaybını incelemektir. Bilgisayar üzerinden başlat'a tıklayarak devrenin A ve B uçları arasına bir voltaj uygulayın.

Model akson boyunca ilk birim uzunluk için voltajı ölçün ve bilgisayar üzerinden takip edin. Voltaj ölçüm probunun kırmızı ucunu breadboard üzerindeki A noktasında sabit tutarken, diğer ucu seri bağlı dirençler arasındaki farklı konumlara taşıyın. Daha uzak konumlardaki voltaj düşüşünü gözlemleyin.

Şimdi bilgisayar üzerindeki durdurma düğmesine basarak kaydı durdurun. Bilgisayara kaydedilen izler üzerindeki voltaj farklarını, imleci kaydedilen her bir darbe üzerine taşıyarak ölçün. İzlerin alt kısmını işaretlemek için sol alt köşede bulunan M işaretleyici imlecini kullanın ve voltaj farkını ölçmek için serbest imleci izin tepe noktasına yerleştirin.

Ekrandan voltaj farkı ölçümünü okuyun ve devre boyunca her bir ölçüm noktası için bunu not defterinize kaydedin. Bir sonraki adım, sinyalin mesafe boyunca üstel azalmasını tanımlamak için kullanılan model hücrenin uzunluk sabitini hesaplamaktır. Her bir voltaj farkı değerini, membran dirençlerinin bir birim olarak kabul edildiği, potansiyel farkın kaynağa olan mesafeye karşı çizildiği bir grafiğe aktarın.

Grafiğinizin yanı sıra, bu devrenin uzunluk sabitini belirleyin. Bir sinir lifinin uzunluk sabiti, membran üzerindeki potansiyel farkın, başlangıç noktasındaki orijinal değerinin %37'sine düştüğü mesafe olarak tanımlanır. Sinir ve kas liflerinin pasif kablo özelliklerini daha iyi simüle edebilmek için, model sinir hücresi hem dirençli hem de kapasitif bileşenler içerecek şekilde genişletilecektir.

Sinir hücresi membranında sadece bir transvers membran direnci bulunmakla kalmaz, aynı zamanda sinir hücresi sinyalini bozan bir yüzey membran kapasitansı da mevcuttur. Bunu simüle etmek için, transvers membrana paralel olarak 10 micro fert kapasitörler bağlayın. Bilgisayardaki breadboard üzerinde dirençler yer almaktadır.

Stimülatörü bir saniye, bir volt, yani 0,5 volt genlik ayarı ve 0,75 hertz impulsları kullanacak şekilde ayarlayın. Ayrıca panelin sağ üst tarafında, veri toplama hızını saniyede 20 K olarak ayarlayın. Ardından ekranın sağ tarafındaki birinci kanala tıklayın.

Kutudaki giriş amplifikatörüne tıklayın. Diferansiyel düğmesine tıklayın ve aralığı beş volt olarak ayarlayın. Tamam'a tıklayın.

Bu değişiklikleri kaydetmek için, veri toplamaya başlamak üzere başlat'a tıklayın. Verileri breadboard üzerindeki aynı noktalardan ölçün. Veri toplama işleminden sonra, kare darbelerden birindeki yükselme süresini genişletmek için yakınlaştırma penceresini kullanın.

İzi yaymak için gerektiği kadar yakınlaştırmayı tekrarlayın. Sinyalin baz çizgiden voltaj izinin tepesine çıkmasının ne kadar sürdüğünü ölçün. Tam olarak düzleştiği noktada.

Potansiyel değişiminin zaman seyrini ve kare darbelerin bozulmasını gözlemleyin. Ayrıca, daha önce olduğu gibi M imleci ve serbest imleci kullanarak ölçülen voltajın 0.2 voltun üzerinde olup olmadığını not edin, voltajdaki değişimi okuyun ve eşik voltajının 0.2 volt olduğunu varsayarak verileri defterinize kaydedin. Her membran direnci için potansiyelin eşiğe ulaşması için geçen süreyi ölçün.

Sonuçlarınızı zamana karşı mesafe olarak grafiğe dökün; miyelin kılıf kalınlığındaki artış, membran kapasitansında bir azalmaya yol açar. Bunu, breadboard üzerindeki 10 µF kapasitörleri daha küçük 0.1 µF kapasitörlerle değiştirerek simüle edin. Önceki deneyi tekrarlayın.

Seçilen bir dirençte eşik değere ulaşma süresindeki değişimi not edin. Daha büyük kapasitörlerin verilerini, önceki zaman-mesafe grafiği üzerine çakıştırın. Miyelin kılıf kalınlığının artması, elektrik sinyallerinin bir sinir hücresinde daha hızlı yükselip alçalmasını sağlar ve böylece iletim hızını artırır.

Deneyin bir sonraki bölümünde, kerevitin ventral sinir kordonundaki aksonların elektrokimyasal özellikleri incelenecektir. Model devrelerde sunulan pasif akım yayılımı özellikleri, canlı preparatlarda da gözlemlenir. Bununla birlikte, hücrelerin pasif elektriksel özellikleri sinyalleri bu mesafe boyunca zayıflatacağından, birkaç milimetrelik bir mesafe boyunca sinyal iletilmesi gerektiğinde bir aksiyon potansiyeline ihtiyaç duyulur.

Sinyaller, kerevit ventral sinir kordonu boyunca farklı iletim hızlarıyla iletildiğinde, en hızlı olanlar önce ve daha yavaş olanlar biraz daha sonra gözlemlenecektir. Benzer iletim hızlarına sahip akson popülasyonuna bağlı olarak, bazı sinyaller kayıtta toplanacaktır. Çok sayıda aksondan gelen bu toplanmış elektriksel sinyale bileşik aksiyon potansiyeli denir.

Bir sonraki deney serisi, kerevitin ventral sinir kordunu elde etmek amacıyla kerevit sinirlerinden bileşik aksiyon potansiyellerini kaydetmeye odaklanmaktadır. Öncelikle, sinir kabı diseksiyon aletlerini ve salin çözeltilerini hazırlayın. Kereviti anestezi altına almak için yaklaşık beş dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.

Anestezi uygulandıktan sonra, kereviti nemli bir kağıt havluya sarın ve kıskaçlarını başparmağınız ile işaret parmağınız arasında tutarak kereviti bir elinizle sabitleyin. Diğer elinizi kullanarak, makasla göz çukurları arasındaki rostrum üzerinden bir kesi yapın. Baş tamamen ayrılana kadar kesi yerinden aşağıya doğru kesin.

Kıskaçları ve yürüyüş bacaklarını çıkarın. Sefalik toraksın karın üzerindeki tabanından bir insizyon yapın ve sefalik toraksı ayırın. Kuyruğu ve yüzgeçleri çıkarın.

Abdomenin ventral tarafının her iki yanından bir kesi yapın. Daha derin dokulara zarar vermemeye dikkat edin. Ventral sinir kordonunu açığa çıkarmak için ekzoskeletin serbest kalan kısmını kuyruk yelpazesinin tabanına kadar geriye doğru soyun.

Pensetin ucunu kullanarak ventral sinir kordonunu uç kısmından dikkatlice çıkarın. Sinir kordonunu germemeye veya ezmemeye dikkat edin. Sinir kordonu üzerinde gözlemlenen her türlü nodül, kerevit gangliyonlarıdır.

Sinir kordonunu sinir odasındaki metal çubukların üzerine yerleştirin. Ventral sinir kordonunu nemli tutmak zorunludur. Bunu sağlamak için, sinir odasına metal çapraz çubuklarla aynı seviyeye ulaşacak kadar kerevit salin çözeltisi ekleyin.

Ardından, sıvının seviyesi çubukların tabanına tam olarak değecek kadar kerevit salin çözeltisini pipetle dışarı alın. Sinir kordu yerleştirildikten sonra, iki adet mini kanca uca sahip stimülatör kablosunu sinir odasına bağlayın. Pozitif kırmızı ucu sinir kordunun ucuna yakın harici metal halkalardan birine, negatif siyah ucu ise yine sinir korduyla temas halinde olan yanındaki metal halkaya bağlayın.

Manipülatörü kullanarak vakum elektrodunu, negatif ve pozitif uçların karşı tarafında, sinirin ucuna yakın bir konuma getirin. Ventral sinir kordonunun ucunu dikkatlice kayıt elektrodunun içine vakumlayın. Vakum elektrodundan gelen bir teli probun pozitif girişine, diğer teli ise negatif girişine bağlayarak elektrodu kafa aşaması probuna sabitleyin.

Hangi kablonun hangi girişe bağlandığı önemli değildir. Prob, bir gümüş klorür tel kullanılarak Faraday kafesine veya salin banyosuna topraklanabilir veya potansiyel 60 hertz gürültüsünü azaltmak için diferansiyel amplifikatördeki toprak girişine bağlanabilir. Probu diferansiyel amplifikatöre takın ve amplifikatörü power lab'e bağlayın.

Eşlik eden makaledeki tabloda gösterilen RS amplifikatör ayarlarını kontrol edin. PowerLab'ı bilgisayara bağlamak için USB kablosunu kullanın. Bilgisayar masaüstünün ekranının sağ üst köşesinde bulunan scope yazılımını açın.

Kanal ikiyi seçin ve kapatın. Ekranın ortasındaki çubuğu ekranın altına sürükleyerek sadece kanal bir görünecek şekilde ekranı ayarlayın. Giriş amplifikatörünü ekteki makalede verilen ayarlarla kontrol edin.

Ardından ekranın üst kısmındaki kurulum (setup) sekmesi altında stimülatörü seçin, izole edilmiş gövdeyi (isolated stem) kapatın ve gecikmeyi (delay) 5 ms, süreyi (duration) 1 ms, pals sayısını 2, aralığı (interval) 15 ms, aralığı (range) 5 V ve genliği (amplitude) 0,5 V olarak ayarlayın. Ventral sinir kordonunu stimüle etmeye başlamak için ekranın sol alt köşesindeki başlat (start) düğmesine tıklayın. Osiloskop veri toplama kutusunda net bir şekilde tanımlanmış bir aksiyon potansiyeli görülmelidir.

Aksiyon potansiyelinin genel şeklini defterinize çizin. Ekranın sol üst köşesindeki sekmeyi kullanarak voltajı yavaşça düşürün. Aksiyon potansiyelinin büyüklüğü, karakteristik dalga formu kaybolana kadar azalacaktır.

Voltajın düşürülmesi, bileşik aksiyon potansiyeline katkıda bulunan nöron sayısını azaltır; bu etkiyi tersine çevirmek için voltaj kademeli olarak artırılır. Daha fazla nöron devreye girdikçe, bileşik aksiyon potansiyeli dalgası büyür. Bu uygulama, bireysel nöronların aksiyon potansiyellerinin tetiklendiği farklı eşik değerlerine sahip olduğu gerçeğini örneklemektedir.

Uyarıcı voltajdaki daha fazla artış bile bileşik aksiyonu artırmadığında, tüm nöronlar devreye girmiş demektir ve bilgisayar ekranında aksiyon potansiyeli dalgasında iki belirgin pik görülmelidir. Deneyin sonraki bölümü, aksonların refrakter dönemini inceler. Ekranın sol üst köşesindeki sekmeyi kullanarak darbeler arasındaki gecikmeyi değiştirin.

İkinci bileşik aksiyon potansiyeli uyarılana kadar gecikme süresini kısaltmaya devam edin. Mutlak refrakter periyot, darbeler arasındaki ikinci bir aksiyon potansiyelinin artık uyarılmadığı zaman gecikmesi olarak tanımlanır. Göreceli refrakter periyot ise, mutlak refrakter periyodun sonundan, ikinci bir uyaran vermenin tam genlikte ikinci bir aksiyon potansiyeli ile sonuçlandığı zamana kadar geçen süre olarak tanımlanır.

Artık heptanoldeki gibi bir gap junction (boşluk bağlantısı) inhibitörünün özelliklerini inceleyebilirsiniz. Ventral sinir kordonu boyunca hangi sinyallerin gap junctionlar aracılığıyla iletildiğini belirlemek için, aynı stimülasyon ayarlarında bileşik aksiyon potansiyellerindeki farklılıklar karşılaştırılabilir. Ayrıca, soğuk veya sıcak salin kullanarak bileşik aksiyon potansiyelini oluşturan çeşitli yapıların iletim hızlarındaki farkları ölçebilirsiniz.

Burada, bir kerevitin ventral sinir kordonundan kaydedilen iki bileşik aksiyon potansiyeli gösterilmektedir. Bu şekil, tam bir bileşik aksiyon potansiyelini takip eden ve ikinci bir uyaranın daha küçük bir bileşik aksiyon potansiyeli oluşturduğu göreli refrakter dönemi örneklendirmektedir. Bu şekil, bu prosedürün ardından heptanolden faydalanmanın bileşik aksiyon potansiyeli üzerindeki etkilerini göstermektedir.

Biyolojik membran devresinin bileşenleri, membrandaki sızıntı kanallarının değişen yoğunluğunun etkisi veya voltaj kapılı kanalların geliştirilmesinden sonraki işlevleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla çeşitlendirilebilir. Bu teknikler ve prosedürler, fizyoloji alanındaki araştırmacıların hücrelerin elektriksel devreler olarak nasıl çalıştığını ve hayvanlardaki canlı dokularda gap junctionların nasıl işlev gördüğünü keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.