Name: Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis endosperminden baskılı genlerin DNA metilasyon durumunu bisülfit dizileme ile nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, bitki genetik araştırmalarında gen ifadesi düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Arabidopsis bitkilerin bakımı için Bayan Jennifer M. Lommel ve Tara N. Rognan teşekkür ederim. Bu çalışma, Saint Louis Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe 1R15GM086846-01 ve 3R15GM086846-01S1 W. Xiao başlangıç ​​fonu tarafından desteklenmiştir.

I. Genetik Crossing 1. Kadın ebeveyn Emasculating DNA dizisi polimorfizm, iki farklı ekotipler, örneğin Columbia-0 (Col-0) ve Ler, kadın ve erkek ebeveynler olarak seçilecektir ile anne ve baba allel ayırmak için. Bitkiler genç ve sağlıklı olmalıdır. Bir büyüteç visor, ya da çıplak gözle, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak dişi ebeveyn hadım. Evre-12 çiçek bulun (Smyth ve ark, 1990) ve makas ile sapçık temel kırpma herhangi bir çiçek veya siliques yukarıda ve aşağıda onları çıkarın . Forseps% 95 etanol forseps üzerinde herhangi bir polen taneleri kaldırmak ve aynı zamanda polen öldürecek bir beher, içine hafifçe ucunun taban batırarak sterilize edin. Yavaşça forseps kullanarak çiçek tomurcukları dışında gözetlemek ve yavaşça dişilik organı çıplak ve zedelemeden, 4 sepals, 4 yaprakları, 6 organlarındaki kaldırmak. Bu işlem sırasında carpels zarar görmesini önlemek için deneyin. 2. Polen donör Toplama ve tozlaşma yürüten Iyi polen donörlerin polen bir çok dökülme olduğu dişilik organı (Smyth ve ark, 1990), 90 ° açıyla uzanan yaprakları ile 14 sahne açık çiçek anthesed. Üssünde çiçek alın ve sapçık hemen üstünde, çiçek açık yayılmasına sebep olacaktır. Anter ile hazırlanan dişilik organı stigma Toz. Tozlaşma sonra, bir mikroskop altında kolayca görülebilir sarı polen, damgalanma ile kaplı olacaktır. 3. Çapraz Etiketleme Bir bitkinin tüm hadım pistils pollinating sonra, biz bir mücevher etiketi ve dişi ve erkek ebeveynler ve güncel bilgi ile çapraz etiket. Toprak bitki yakın bir hissesi yerleştirin, bir dize, kazığa gelişme kök bağlamak için kullanın ve plastik bir çanta ile tozlaşma pistils kapağı. II. Arabidopsis endosperm Dokular izolasyonu 1. Hazırlanması malzemeleri : Biz genellikle bir sıvı nitrojen tankı, sıvı azot, bir diseksiyon mikroskobu ucu ince forseps (Dumont biyoloji tarafından 5 INOX FST, İsviçre), mikroskop cam slaytlar iki yeni çift (endosperm ve embriyo dokuları hasat öncesi gerekli malzemeler hazır 3 "X 1" X 1.0 mm), sorbitol 0.3 M pH 5.7 çözümü ve 5 mM (MES). 2. Toplama siliques 7 - veya 8-gün sonra-tozlaşma (DAP), tohum, orta ve geç torpido sahne embriyogenez hasat ve endosperm ve embriyo için disseke hazırız. Bazen hadım çiçekler çok genç, 9-10 DAP sürebilir. 3. Yalıtımlı endosperm ve embriyo Arabidopsis tohumu küçük olduğundan, endosperm ve embriyo izole etmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. 8-DAP silique bir mikroskop altında bir koyun, silique sapçık tutmak için forseps, bir çift ve iki carpels sigorta marjı açık silique slayt forseps başka bir çift ucu kullanın. PH 5.7 sorbitol 0.3 M ve 5 mM MES çözümler üzerine bir tohum almak için forseps bir çift kullanın, embriyo slayt micropyle sonunda küçük bir kesim yapmak, endosperm ve tohum kabuğu ayrı endosperm dışarı itmek için kesilmemiş sonuna sıkmak (Kinoshita ve ark, 2004). Embriyo ve endosperm sıvı nitrojen içinde ayrı mikrotüpler içine koyun. 10-15 siliques embriyo ya da endosperm birikir kadar bu devam edin ve sonra tüp -80 ° C derin dondurucuda saklayın. Bazı durumlarda, endosperm, tohum kabuğu, yani ayrılmış olması değil, tek bir gen imprinting analizi için endosperm ve tohum kabuğu karışımı total RNA izole. III. Bisülfit Sıralama 1. Gerekli reaktifleri Genomik DNA, restriksiyon enzimleri, 3 M NaOH (Taze yapılmış), 6,42 M üre / 4 M sodyum bisülfit (190 2 M sodyum metabisülfit, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Moleküler Ağırlık) hazırlamak için Cetyltrimethyl amonyum bromür (STAB) 10 mM hidrokinon, bir DNA temizleme kiti (Promega Sihirbazı DNA Temizlik Sistemi, Kedi # A7280), TE tampon, 6.3 M NaOH (taze yapılmış), 10 M NH 4 oac, 20 mikrogram / ​​mcL tRNA ve% 100 etanol . 2. Bisülfit tedavi protokolü Detayları <ol><li> Genomik endosperm veya CTAB yordamı kullanarak embriyonun DNA (Rogers ve Bendich, 1988) kesin. </li><li> Digest 100 ng - 20 mcL 100 mcL toplam hacmi analiz edilecek bölge dışından kesen restriksiyon enzimleri ile genomik DNA 2 mg. MEA organizatörü için, biz XhoI, NdeI ve PstI veya HindIII kullanın. </li><li> DNA beş dakika kaynatarak restriksiyon enzimlerinin denatüre ve ardından buz üzerinde gidermek. </li><li> 15 dakika boyunca 37 1 / 9, 3 M NaOH ve inkübe hacmi (20 mcL sindirilir DNA 2.2 mcL) ° C ekleyin. </li><li> 250 mcL PCR tüp çözüm aktarın. </li><li> 10 ml steril distile su, 7.5 g üre çözülür; yavaş yavaş ekleyin ve 1-2 saat içinde 7.6 g sodyum metabisülfit ısıtma genellikle erime yardımcı olur; pH 5 ile 10 M NaOH taze yapılmış ayarlayın; bir final steril distile su ekleyin 20 ml hacim. Bu 6.24 M üre / 4 M sodyum bisülfit çözüm. </li><li> Sırasıyla 6.24 M üre son konsantrasyonu 5.36 M / 4 M sodyum bisülfit çözüm ve 3.44 M (Paulin ve ark, 1998). Örneğin, 6,42 M üre / denatüre genomik DNA (Xiao ve ark, 2003) Yukarıdaki 22.2 mcL 4 M sodyum bisülfit çözümü 208 mcL ekleyin. </li><li> 0.5 mM (20 mcL sindirim için 12 mcL) son bir konsantrasyonda DNA 10 mM hidrokinon ekleyin. </li><li> 55 ° C de 15 dakika ve 95 ° C 'de 30 saniye için 30 kür: PCR makinesi bisülfit tedavi yapılması </li><li> Promega Wizard DNA Temizlik-Up Sistemi kullanılarak bisülfit tedavi DNA Desalt ve protokolü takip (Jacobsen ve ark, 2000). </li><li> TE tuzsuzlaştırma sonra sütun kurtarıldı tam hacmi ölçün ve 37 0.3 M. inkübe son konsantrasyonu 6.3 M NaOH eklemek ° C 15 dakika boyunca. </li><li> 3 M nihai bir konsantrasyon, 2 mcL 20 mikrogram / ​​mcL tRNA ve 3 hacim% 100 etanol ile 10 M NH 4 oac (pH 7.0) ekleyin ve karıştırın. 14.000 rpm'de 15 dakika santrifüj. </li><li> Bir kez,% 70 etanol ile pelet yıkayın kısa bir santrifüj yapmak ve ekstra etanol çıkarın. </li><li> 5-10 dakika ve 25 tekrar süspansiyon için speedvac Kuru pelet - DNA miktarı başlangıç ​​bağlı olarak 100 mcL TE tampon. Sodyum bisülfit ile tedavi edilen DNA PCR analizi için hazırdır. </li></ol> 3. PCR <ol><li> Unmethylated cytosines urasil dönüştürülmüş olduğundan, bu büyük bir parçası, bir şablon olarak bisülfit ile tedavi edilen DNA kullanarak yükseltmek için zordur. Böylece, genellikle bir ürün artık 500 bp daha yükseltmek için primerler dizayn. 4-kb MEA organizatörü dizisi için astar birçok setleri tasarlanmış ve tüm bölgeyi kapsayacak şekilde 14 örtüşen parçaları amplifiye (Xiao ve ark, 2003). </li><li> Üst iplikçik dizisi için ileriye astar, I) tasarımında primerleri ekstra uzun nükleotidler olmadan daha yüksek bir tavlama sıcaklığı için G (guanin) açısından zengin bir bölge seçin; II) değişiklik C (Sitozin) Y ( CG ve CNG bağlamlarda pirimidin) ve T (Timin) kalan C değiştirin. Ters astar, I) tasarımı C-zengin bir bölge seçin; II), CG ve CNG bağlamlarda R (pürin) G değiştirmek ve kalan G A (adenin) değiştirin. </li><li> CG ve CNG bağlamlarda R G değişikliği ve seçim ters astar, I) tasarımı A. kalan G değiştirmek II); alt sırasına iplikli, ileriye astar, I) tasarımı C-zengin bir bölge seçin G-zengin bir bölge; II) Y (pirimidin), CG ve CNG bağlamlarda C değiştirmek ve T. kalan C değiştirmek </li><li> Biz genellikle her PCR (Xiao ve ark, 2003) için bir şablon olarak sodyum bisülfit ile tedavi edilen DNA 1-2 mcL kullanın. PCR ürünü Parçanın doğru boyutu onaylamak için sonra bir ekleme olarak jel saflaştırılmış ve TOPO TA klonlama vektörü pCR2.1 (Invitrogen) klonlanmış olması, jel elektroforezi ile analiz edilmesi gerekiyor. Tek bir koloni aldım ve kültür; plazmid DNA ayıklanır ve sıralama için gönderilir. </li></ol> 4. Sekans analizi Bisülfit sıralama ilkesi unmethylated sitozin PCR ürünü timin olarak yükseltilecek pH5.0 yüksek konsantrasyonda sodyum bisülfit hidrolitik deaminasyon nedeniyle urasil dönüştürülür olacak, 5-metil sitozin sodyum bisülfit tarafından güncellenmiştir izin vermeyecek ve PCR (. Frommer ve ark, 1992. Clark ve ark, 1994) sonra sitozin kalır. Sıralama sonucu elde ettikten sonra, PCR için kullanılan iplikçik belirli bir şablon ile karşılaştırın. Şablonu bir sıralama sonucu bir timin sitozin kalıntı olarak okursa, sitozin metil olmadığını gösterir. Şablonda bir sitozin kalıntı sıralama bir sitozin kalırsa, sitozin metil olduğu anlamına gelir. IV. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Şekil 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1 /"> Şekil 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Embriyo, endosperm ve tohum kabuğu ayırmak için nispeten kolaydır, ancak embriyogenez erken veya orta-torpido aşamada özellikle tohum tohum kabuğu, endosperm ayrı sıkıcı. Tohum kabuğu, sadece bazı genler için çok küçük bir miktar doku katkıda bulunmasından dolayı, örneğin, MEA ve FWA, endosperm, tohum kabuğu ayırmak zorunda değilsiniz. Endosperm ve tohum kat dokularda oluşan bir karışım RNA&#39;lar tecrit anlamına gelir ki, bir genin anne ve baba allel ifade, embriyo ifade ile karşılaştırın ve genin im...

Sarf Malzemeleri <ul><li> Diseksiyon Mikroskop </li><li> Makas </li><li> İnce İpucu Forseps </li><li> Takı Etiketi </li><li> Bitki Stakes </li><li> String veya Döndür-Kravatlar </li><li> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;Polietilen Çanta </li><li> 3 &quot;X 1 X 1,0 mm Mikroskop Slaytlar </li><li> Sıvı Azot </li><li> Sıvı Azot Konteynerler </li><li> Isı Blok </li><li> PCR Tüpleri </li><li> PCR </li><li> Mikrosantrifüj Tüpler </li><li> Mikrosantrifüj </li><li> Jel Elektroforez tesisi </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 Tesisleri </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta&#39;nın Tesisleri </li></ul> Reaktifler <ul><li> % 70 Etanol </li><li> % 95 Etanol </li><li> % 100 Etanol </li><li> Sorbitol 0,3 M ve 5 mM MES-pH 5.7 </li><li> Cetyltrimethyl Amonyum Bromür (STAB) </li><li> % 100 Etanol </li><li> Cholorform </li><li> Kısıtlama Enzimler </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6.3 m NaOH </li><li> 6,24 M Üre / 4 M sodyum bisülfit </li><li> Steril distile H 2 O </li><li> 10 mM hidrokinon </li><li> Sihirbazı DNA Temizlik Sistemi (Promega) </li><li> 10 M NH 4 oac </li><li> 20 mikrogram / mcL tRNA </li><li> TE tampon </li><li> TOPO TA Klonlama Kiti (Invitrogen) </li></ul>

baskılı genler dna metilasyon belirlenmesi arabidopsis endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana epigenetik mekanizmalar çalışmak için mükemmel bir model organizmadır. Nedenlerinden biri DNA methyltransferases kaybı fonksiyon-boş mutant böylece bir genom DNA metilasyon kaybı, büyüme ve gelişme nasıl etkilediğini incelemek için bir sistem sağlayarak, yaşayabilir. Basma maternal ve paternal allellerin diferansiyel ifadesi anlamına gelir ve hem de memeli hayvan ve bitkilerin üreme gelişmesinde önemli bir rol oynar. DNA metilasyon baskılı bir gen anne veya baba allel ifade ya da susturulmuş olup olmadığını belirlemek için kritik öneme sahiptir. Çiçekli bitkiler, bir çift üreme döllenme olayı var: tek bir sperm hücresi yumurta hücresi embriyo ve endosperm yol vermek için merkezi bir hücre ile ikinci bir sperm sigortalar oluşturmak için döller. Endospermi imprinting, bitkilerde meydana gelen bir dokudur. MEDEA, bir SET etki Polycomb grup gen, FWA, çiçekli düzenleyen bir transkripsiyon faktörü, endosperm ve kendi ifade baskılı gösterilen ilk iki gen, DNA metilasyon ve demetilasyon tarafından kontrol edilir bitkiler. Bir gen ve endosperm metilasyon paterni imprinting durumunu belirlemek amacıyla, ilk endosperm izole etmek gerekir. Tohum Arabidopsis ufak olduğundan, Arabidopsis endosperm izole ve metilasyon incelemek için zorlu kalır. Bu video protokolde, tohumları endosperm doku izole etmek için, genetik bir çapraz yapmak ve bisülfit sıralama metilasyon durumunu belirlemek için nasıl rapor.

Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun belirlenmesinde<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Zor olabilir. Bu protokol, endosperm izole ve metilasyon bisülfit sıralama tarafından nasıl belirleneceği açıklanmaktadır.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana, epigenetik mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Bunun nedenlerinden biri, DNA'nın fonksiyon kaybı null mutantıdır...

Bu prosedürün genel amacı, endospermdeki imprintlenmiş genlerin DNA metilasyon durumunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle dişi ebeveynin emasculasyonunun yapılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından dişi ebeveyn, erkek ebeveynin polenleri ile tozlaştırılır.Ardından, çapraz tozlaştırılmış tohumdan endosperm diseke edilerek çıkarılır. Prosedürün son adımı, endosperm DNA'sının bisülfit sekanslamasının gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, farklı ekotiplerdeki DNA sekanslama polimorfizmi ve bisülfit sekanslama yoluyla, imprintlenmiş bir genin maternal veya paternal alelinin DNA metilasyon durumunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben St. Louis Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Dr. Yang Shaw. Merhaba, ben Dr. J Laboratuvarı ve St. Louis Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Matthew Ray. Ben de Dr. J'nin laboratuvarından Diman Panu.Bugün size bir rugby officer diseksiyonu yapma ve sulf FAR sekanslama yoluyla DNA metilasyon durumunu belirleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, DNA metilasyonu ve demetilasyonu tarafından düzenlenen gen imprintingini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, DNA dizisi polimorfizmini kullanarak maternal ve paternal alelleri ayırt edebilmek amacıyla dişi ve erkek ebeveyn olarak görev yapacak iki farklı Arabidopsis ekotipi seçin. Burada dişi ve erkek ebeveynler olarak sırasıyla Columbia zero ve Landsberg Erecta seçilmiştir. Genç ve sağlıklı bitkiler seçmeye özen gösterin.Dişi ebeveyni, bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla hadım edin. 12. evre çiçekleri bulun ve bunların üstündeki veya altındaki tüm çiçekleri veya LIC'leri, pedestal tabanını makasla keserek çıkarın. Pensleri, uç kısmının tabanını 95% ethanol içeren bir behere nazikçe daldırarak sterilize edin.Bu işlem, pens üzerindeki tüm polen tanelerini temizleyecek ve polenleri öldürecektir. Çiçek tomurcuklarını pens yardımıyla nazikçe aralayın ve pistili çıplak ve bozulmamış halde bırakarak dört sepal, dört petal ve altı stameni dikkatlice çıkarın. Bu işlem sırasında karpellerin zarar görmemesine dikkat edin.Bir sonraki adım, polen donörünü seçmek ve tozlaşmayı gerçekleştirmektir; en iyi polen donörleri, taç yaprakların pistile 90 derecelik açıyla uzandığı ve bol miktarda polen döktüğü 14. evredeki açık çiçeklerdir. Çiçeği tabanından ve pedestalin hemen üzerinden tutun, bu işlem çiçeğin tamamen açılmasını sağlayacaktır. Hazırlanmış pistilin stigmasını anterle tozlayın.Tozlaşmadan sonra, stigma sarı polenlerle kaplanacak ve bu durum mikroskop altında kolayca gözlemlenebilecektir. Bir bitki üzerindeki tüm eksikleştirilmiş pistiller tozlaştırıldıktan sonra, melezlemeyi mücevher etiketiyle işaretleyin. Tarihi, dişi ve erkek ebeveynlerin bilgilerini ekleyin.Bitkinin yakınına toprağa bir destek çubuğu yerleştirin. Floresans altındaki gövdeyi destek çubuğuna bağlamak için bir ip kullanın ve tozlaşmış pistilleri plastik bir torba ile kapatın. Tozlaşmadan yedi veya sekiz gün sonra (DAP), tohumlar embriyogenezin orta ile geç torpedo evresinde hasat edilmeye ve diseke edilmeye hazır olmalıdır.Endosperm ve embriyo için, sekiz DAP'lık bir salic'i diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Bir pens yardımıyla EK P hücresini tutun ve başka bir pensin ucuyla, iki karpelin birleştiği kenardaki açıklığı kaydırarak açın. Bir adet tohumu almak için BPS kullanarak onu bir lam üzerine yerleştirin.Ardından, embriyoyu kaydırarak çıkarmak için mikro yığın ucunda küçük bir kesik açın. Endospermi dışarı itmek ve onu tohum kabuğundan ayırmak için kesilmeyen ucu sıkın. Sonrasında, embriyoyu ve endospermi ayrı mikro tüplere ve sıvı azota yerleştirin.10 ila 15 CLIC'ten yeterli embriyo veya endosperm birikene kadar bu işleme devam edin. Ardından, bisülfit işlemi öncesinde tüpleri -80 °C dondurucuda saklayın. Hassas bir trimetil amonyum bromür veya CTAB prosedürü kullanarak genomik endosperm veya embriyo DNA'sını izole edin.Endosperm genomik DNA'sı izole edildikten sonra, analiz edilecek bölgenin dışından kesen restriksiyon enzimleri ile 20 µL toplam hacimli bir reaksiyonda 100 ng DNA'yı sindirin. ME promotörü restriksiyon enzimleri için xh, O one ND one ve PST one kullanılır. DNA'yı beş dakika boyunca kaynatarak restriksiyon enzimlerini denatüre edin.Ardından reaksiyonu buz üzerinde durdurun. Bir dokuz hacminde veya 2,2 µL 3 M sodyum hidroksit ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından çözeltiyi 250 µL'lik bir PCR tüpüne aktarın.Ardından, 10 mL steril distile suda 7,5 g üre çözerek 6,24 molar üre içeren dört molar sodyum metabisülfit çözeltisi hazırlayın; çözelti ısıtılıp karıştırılırken 7,6 g sodyum metabisülfiti bir ila iki saat boyunca yavaşça ekleyin. Çözünme tamamlandığında, pH değerini taze hazırlanmış 10 molar sodyum hidroksit ile beşe ayarlayın.Final hacim 20 mililitre olacak şekilde steril distile su ekleyin. Bu çözeltiden 208 mikrolitre alarak 22,2 mikrolitre denatüre endosperm genomik DNA'sına aktarın. Ardından, DNA'ya taze hazırlanmış 12 mikrolitre 10 milimolar hidrokinon ekleyin.Bisülfit işlemini, bir PCR cihazında, 15 dakika boyunca 55 °C ve ardından 30 saniye boyunca 95 °C şeklinde 30 döngü uygulayarak gerçekleştirin. Ardından, bisülfit ile işlem görmüş DNA'yı Promega'nın wizard, DNA cleanup sistemi ile tuzdan arındırın. Üretici talimatlarına uygun olarak, tuzdan arındırma işleminden sonra kolondan geri kazanılan TE'nin kesin hacmini ölçün.Ardından, son konsantrasyon 0.3 molar olacak şekilde 6.3 molar sodyum hidroksit ekleyin. Karışımı 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, son konsantrasyon üç molar olacak şekilde 10 molar amonyum asetat, iki µL 20 µg/µL tRNA ve üç hacim %100 etanol ekleyin.Numuneyi karıştırın ve 14.000 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti bir kez %70 etanol ile yıkayın ve ardından fazla etanolü uzaklaştırmak için kısa süreli bir santrifüj işlemi uygulayın. Son olarak, peleti bir vakum blokunda beş dakika boyunca kurutun ve 25 µL TE tamponu içerisinde yeniden süspande edin.Sodyum BI sitrat ile işlem görmüş DNA artık PCR analizi için hazırdır. Dört kilobazlık Madea promotörünü sekanslamak için birçok primer seti tasarlayın ve tüm bölgeyi kapsayacak şekilde 14 örtüşen fragman amplifiye edin. Üst zinciri sekanslamak için bir ileri primer tasarlayarak başlayın.İlk olarak, primerlerde ekstra uzun nükleotidlere ihtiyaç duymadan daha yüksek bir tavlama sıcaklığına sahip olmak için guanin bakımından zengin bir bölge seçin. Ardından, CG ve C NG bağlamlarındaki sitozinleri purine ile değiştirin. Daha sonra, diğer tüm sitozinleri timine dönüştürün.Ters primer tasarlanırken, sitozin açısından zengin bir bölge seçin. CG ve CNG bağlamındaki guaninleri pürinlerle ve diğer tüm guaninleri adenin ile değiştirin. Alt zinciri tekrar sekanslamak için, ileri bir primer tasarlayarak başlayın.Sitozin bakımından zengin bir bölge seçin ve CG ile CNG dizilimlerindeki guaninleri pürinlerle değiştirin. Diğer guaninleri adeninle değiştirin. Ters primer tasarlanırken, AINE bakımından zengin bir bölge seçin.CG ve CNG bağlamlarındaki sitozinleri paridine, geri kalan sitozinleri ise timine dönüştürün. Primerler tasarlandıktan sonra, her bir PCR amplifikasyonu için şablon olarak iki µL sodyum bisülfit ile işlem görmüş DNA kullanarak bir PCR reaksiyonu hazırlayın. PCR reaksiyonunu gerçekleştirin ve fragmanın doğru boyutunu doğrulamak için ürünü jel elektroforezi ile analiz edin.Ardından jel elektroforezi yapın. PCR ürününü saflaştırın ve Invitrogen topo TA klonlama vektörü PCR 2.1'e klonlayın. Bir ekleme olarak bireysel klonları dizileyin; bisülfit dizileme prensibi, pH 5.0'da yüksek konsantrasyonlu sodyum bisülfit ile gerçekleşen hidrolitik deaminasyon nedeniyle metillenmemiş sitozinin urasile dönüştürülmesidir.Aksine, 5-metilsitozin sodyum sülfit tarafından modifiye edilmeyecektir. PCR ürününde urasil, timin olarak amplifiye edilirken, metillenmiş sitozin PCR amplifikasyonundan sonra sitozin olarak kalacaktır. Sekanslama sonucunu elde ettikten sonra, bunu PCR amplifikasyonu için kullanılan zincire özgü şablonla karşılaştırın.Kalıptaki bir sitozin kalıntısı sekanslama sonucunda timin olarak okunursa, bu durum sitozinin metillenmediğini gösterir. Kalıptaki bir sitokin kalıntısı sekanslama sonucunda sitozin olarak kalırsa, bu durum sitozinin metillendiği anlamına gelir; Columbia, g Clarus ile RLD endosperminin çaprazlandığı sekanslanmış klonlarda, MEA promotörünün eksi 500 baz çifti bölgesindeki beş metillenmiş CpG bölgesi için maternal MEA alelinin metilasyon durumu gösterilmiştir; metillenmiş sitozinler siyah dolu dairelerle, metillenmemiş sitozinler ise beyaz boş dairelerle belirtilmiştir. Benzer şekilde, Columbia, Gladys ile RLD embriyosunun maternal Madea aleli için metilasyon durumu gösterilmiştir.Bu prosedürü uygularken endospermin nasıl izole edileceğini ve sülfit sekanslamanın nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk. Protokole doğru şekilde uymayı hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Yeni 5-metilsitozin (oksi-mCs), 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) oksitlenmiş formları bulunan ve 5-carboxylcytosine (5caC) farklı DNA değişiklikleri benzersiz işlevsel roller ile temsil edebilir. Yarı nicel bir iş akışı görselleştirme oksi-mCs kayma dağıtım, sinyal şiddeti profil oluşturma ve colocalization için burada kullanılmıştır.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Bu çalışma, mikroarray teknolojileri tarafından elde edilen DNA metilasyon verilerini yönetmek için iş akışını açıklamaktadır. Protokol, numune hazırlamadan veri analizine kadar olan adımları gösterir. Tüm prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve video önemli adımları göstermektedir.

DNA Metilasyonunun Biyoinformatik Analizine Örnek Hazırlama: Obezite ve İlgili Özellik Çalışmaları için Dernek Stratejisi

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Öğrenin, Arabidopsis endosperminden baskılı genlerin DNA metilasyon durumunu bisülfit dizileme ile nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, bitki genetik araştırmalarında gen ifadesi düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Daha fazla video keşfet