Name: Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin C. elegans'ta transgen üretimi için recombineering yöntemini; GalK seçilebilir marker kullanarak yerel düzenleyici öğeleri koruyun. Bu teknik hızlı ve verimli genetik modifikasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Lindsey Nash tekniğin geliştirilmesi ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Pittsburgh Üniversitesi, Pittsburgh OAIC Üniversitesi (AG024827) ve tohum fonları bir pilot proje hibe ALF, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe AG028977 tarafından finanse edildi.

<ol><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-12+encodes+a+nuclear+receptor+that+regulates+the+dauer+diapause+and+developmental+age+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans.</a> Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).</li>
<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
<li>Lehrbach, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN-28+and+the+poly%28U%29+polymerase+PUP-2+regulate+let-7+microRNA+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).</li>
<li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li>
<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
<li>Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+pipeline+for+functional+genomics+applied+to+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).</li>
<li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li>
<li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+using+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li>
<li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+MW005%3A+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li>
<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

Fosmids gelen transgenlerin nesil ana organizatörü elemanları, splice varyantları ve 3 &#39;UTR düzenleyici elemanlar tüm istinat yararına sunmaktadır. Bu yerli ifade desen, ya da diğer yaklaşımlar başarısız 5 işlevsel bir transgen inşaat daha yansıtıcı bir transgen inşaat yol açabilir . Ortaya çıkan transgenlerin GFP veya TAP etiketi epitopu etiketleri de dahil olmak üzere çeşitli taşıyabilir. Transgenlerin inşaatı tüm SW106 bakteriyel leke 15 yürütülmektedir üç adım y...

<table><tbody><tr><td>FosmidMAX kiti</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>MOPS Besiyeri</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>0.132 M Potasyum fosfat çözeltisi</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-deoksigalaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biyotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Lösin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey agar bazlı besiyeri</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

Üretimi c. elegans recombineering yoluyla transgenlerin galk seçilebilir marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Transgenik hayvanların yaratılması, yaygın olarak C. kullanılmaktadır elegans araştırma, düzenleme ve faiz veya tandem afinite arıtma nesil (TAP) belirli genlerin sürümlerini kendi arıtma kolaylaştırmak için etiketli genlerin ifade desen çalışma GFP füzyon proteinleri kullanımı da dahil olmak üzere . Genelde transgenlerin GFP muhabiri gen ya da ilgi cDNA yukarı organizatörü koyarak üretilir ve bu genellikle temsil eden bir ifade kalıbı üretmektedir. Ancak, gen regülasyonu, 3 &#39;çevrilmemiş bölge ya da alternatif rehberleri kontrol elemanları gibi kritik unsurlar, bu yaklaşım tarafından kaçırılmış olabilir. Ayrıca sadece tek bir ek çeşidi genellikle bu yolla incelenebilir. Aksine, fosmid DNA klonları tarafından yapılan solucan genomik DNA muhtemelen içerir, en gerçek ifade desen ve zamanlama yakalamak için daha fazla yetenek izin in vivo gen regülasyonu ilgili tüm unsurlar değilse . Fosmid DNA kullanarak transgenlerin üretimi kolaylaştırmak için, E. tarif coli gen herhangi bir yere GFP, TAP-etiket veya ilgi diğer dizileri eklemek için recombineering prosedür. Bu prosedür, yüksek verimlilik ile istenilen değişiklik elde sonuçlar recombineering pozitif ve negatif seçim adımları hem galK gen seçim belirteci olarak kullanır . Ayrıca, yaygın olarak kullanılan GFP homoloji kolları ile çevrili ve füzyon genleri TAP galK genini içeren plazmid GFP veya TAP füzyon proteini oluştururken,% 50 oranında oligos maliyeti azaltmak mevcuttur . Bu plazmid geniş PCR ürün arıtma için ihtiyaç engellemektedir R6K çoğaltma kökenli kullanın. Nihayet, biz de unc-119 işaretleyici fosmid doğrudan enjekte veya transgenik hayvanlar üretmek için solucanlar içine bombardıman olanak sağlar fosmid omurgasına entegre bir teknik göstermektedir. Bu video bu yöntemi kullanarak recombineering üzeri transgen üreten yer alan usul göstermektedir.

Için transgenlerin üretme yeteneği<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Tüm yerli düzenleyici unsurların korunur fosmids tarafından yapılan genomik DNA kullanarak özellikle çekici. Transgenlerin üretimi için basit ve sağlam bir prosedür ile recombineering yoluyla. Açıklanan<em&gt; GalK</em&gt; Seçilebilir işaretleyici.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

GFP füzyon proteinlerinin regülasyonu ve ... incelemek üzere kullanımı da dahil olmak üzere, transgenik hayvanların oluşturulması C. elegans araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir SMID kütüphane klonunda taşınan solucan genomik DNA'sını kullanarak transgenler üretmektir. Genomik DNA'nın kullanımı, üç prime UTR bölgelerindeki enhansörler gibi tüm doğal kontrol elementlerini korur. Bu, indüklenebilir lambda red rekombinasyon mekanizmasını kullanmak amacıyla FO smid'in SW 1 0 6 E. coli sucuna aktarılmasıyla gerçekleştirilir.İkinci bir adım olarak, GFP veya tap etiketinin yerleştirileceği bölgeyi işaretleyen GAL K geni, FO smid içindeki istenen konuma yerleştirilir. Ardından, modifiye transgeni oluşturmak amacıyla, Gade geni homolog rekombinasyon yoluyla GFP veya bir tap TAC ile değiştirilir ve bunu deoksi galaktoz kullanılarak yapılan negatif seleksiyon takip eder. Koloni PCR ile T eklemesinin doğrulanması sonucunda, bu transgenlerin hızlı ve başarılı bir şekilde oluşturulabildiği görülmüştür.Merhaba, benim adım Love Ship. University of Pittsburgh'daki Fisher Laboratuvarı'nda çalışıyorum. Bugün, C. elegans transgeni hazırlama tekniğini gösteriyorum.Neden seçilebilir belirleyici olarak GK ile rekombinasyon yapıyoruz? Bu tekniğin Cogan Transgenleri oluşturmadaki mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu teknikte ilgilenilen geni

the-production-c-elegans-transgenes-via-recombineering-with-galk

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi...

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Öğrenin C. elegans'ta transgen üretimi için recombineering yöntemini; GalK seçilebilir marker kullanarak yerel düzenleyici öğeleri koruyun. Bu teknik hızlı ve verimli genetik modifikasyon sağlar.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Daha fazla video keşfet