İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Bu prosedürün genel amacı sperm morfolojisini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak erkeklerin bir gün önceden diseksiyon için izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, spermi serbest bırakmak için erkekleri incelemektir.

İşlemin üçüncü adımı, sperm morfolojisini görselleştirmektir. İşlemin son adımı, spermi aşağı akış uygulamaları için hazırlamaktır. Sonuçta, sperm morfolojisini ve in vitro aktivatörlerle tedavi yoluyla aktive etme yeteneğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Sperm izolasyonu ve aktivasyon protokolü ilk olarak 30 yıl önce Sam Ward, Diane Shakes ve Gregory Nelson tarafından geliştirilmiştir. Şu anda bu prosedürü, C zarafetinde sperm fonksiyonunu ve doğurganlığı değiştiren mutasyonları karakterize etmek için kullanıyoruz. Bu işlemin genel amacı CL elgan a OID sperm morfolojisini görüntülemektir.

Bu, bekar kalmalarını sağlamak için diseksiyondan bir gün önce erkekleri izole ederek gerçekleştirilir. İkinci adım, yuvarlak non-modal spermatidleri serbest bırakmak için erkeklerin diseksiyonunu içerir. Üçüncü adım, spermatid aktivasyonunu in vitro olarak olgun AME sperm morfolojisine görselleştirmektir.

Prosedür, laboratuvardaki üç doktora sonrası araştırmacı, Dr.Matt Marchello, Dr ve Chatterjee ve spermi izole etmek için Dr.Guna SLU tarafından gösterilecektir. İlk olarak, küçük bir e coli çimi üzerinde beş vahşi tip erkek ve bir hermafroditi geçerek çok sayıda erkek elde edin. OP 50 bakteri, bir nematod büyüme ortamının veya NGM plakasının merkezinde oturuyor.

Gelecek neslin yaklaşık %50'si toplanacak vahşi tip erkekler olacak. L dört evreli erkekler, diseksiyon mikroskobu altında gelişim evresini ve kuyruk morfolojisini inceler. L dört aşamalı bir solucan, kuyruk morfolojisine göre seçilir.

Bir erkek solucanın yuvarlak bir kuyruğu vardır, bir hermafroditin ise sivri bir kuyruğu vardır. Bir platin tel kullanarak, deney başına yedi ila 10 L dört aşamalı erkek seçin ve bunları OP 50 ile tohumlanmış bir NGM plakasına aktarın ve bir veya iki gün büyümelerine izin verin. Hermafroditlerin yokluğunda büyüyen bekar erkekler sperm kaybını önler ve bu nedenle deneysel prosedür sırasında çok sayıda sperm mevcut olacaktır.

Diseksiyona başlamadan önce, altı gram DI sodyum hidrojen fosfat, üç gram mono potasyum fosfat, beş gram sodyum klorür 0.25 gram magnezyum sülfat, litre başına hidrat için hep ve beş mililitre sperm ortamı kullanarak bir litre M dokuz tamponu hazırlayın Sperm aktivasyonu için, M dokuz tamponu ve sperm ortamı otoklav veya filtre ile sterilize edilmiş stok solüsyonlarından hazırlanır. Diseksiyon gününde, bekar erkekleri bakteri içermeyen bir NGM plakasına aktarın ve birkaç dakika taramalarına izin verin. Bu adım, solucanların yüzeyine yapışan küçük e coli tabakasının çıkarılmasına yardımcı olur.

Alternatif olarak, bir saat camına küçük bir hacimde M dokuz tampon pipetleyin ve erkekleri tampona aktarın. Daha sonra, bir pat kalemi kullanarak, Mark A.Daire içinde 30 ila 50 mikrolitre bir x sperm ortamında bir cam sürgülü boru üzerinde küçük bir daire çizin. Pat kaleminin hidrofobik çemberi, sperm ortamının sınır içinde tutulmasına yardımcı olur.

Bir diseksiyon kapsamı kullanarak beş ila 10 erkeği sperm ortamına aktarın. Konfor seviyesine bağlı olarak bir veya iki şırınga tutun. Her iki elinize de 27 gauge iğne ile takılı, solucanı tutmak için bir iğne kullanın ve sidleri serbest bırakmak için erkeklerin arka ucunu kesmek için diğer iğneyi kullanın.

Serbest bırakılan spermatidler, stereo mikroskop altında küçük granüller halinde görülebilir. Bununla birlikte, bazen spermatidlerin bir kısmı veya çoğu karkas içinde tutulabilir. Bu durumda, karkasın cam sürgün üzerinde nazikçe sürüklenmesi, spermatidlerin karkastan salınmasını kolaylaştırabilir.

Spermatidlerin aktivasyonunu görselleştirmek için, solucanları P pronase E içeren bir x sperm ortamında inceleyin.Diseksiyon mikroskobu altında, solucanın beş dakika oturmasına izin verin. Aktive edilmiş sperm psödopodlara sahip olacaktır. Diseke edilen numunenin yüzeyine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin.

100 x büyütme altındaki spermatid alanını bulun. Spermatidler yuvarlak bir şekle sahiptir. Erkek C zarafetinden izole edilen spermatidlerin bir DIC görüntüsünün bir örneği şekil bir'de gösterilmiştir.

Spermatidler küre şeklindedir ve çekirdekler belirgindir. İn vitro aktive edilmiş spermler şekil ikide gösterilmiştir, spermatozoaların belirgin bir psödopodu vardır. İhtiyaç halinde spermatidlerin %80-95'i spermatozoaya dönüştürülür.

Prosedürün son adımı, spermi aşağı akış uygulamaları için hazırlamak olabilir. Örneğin, sperm immünofloresan için sabitlenebilir. Sonuç olarak, elde edilen sonuçlar spermi in vitro olarak aktive etme ve sperm morfolojisini test etme yeteneğini gösterebilir.