Name: İnsan T lenfositleri, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum Tüm Hücre Kayıt (Kerek) Akımlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Öğrenin, insan T lenfositlerinde CRAC kanal akımlarını tam hücre yama kelepçesi tekniğiyle nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem, kalsiyum sinyalleşmesini ve T hücre aktivasyonunu anlamak için güvenilir elektrofizyolojik ölçümler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tesisleri ve iyon kanalları çalışmaları için mükemmel bir ortam sağlamak için Fizyoloji Anabilim Dalı ve Membran Biyoloji, University of California Davis müteşekkiriz.

1. Dinlenme İnsan T Lenfositler hazırlanması <ol><li> RosetteSep İnsan T Hücre Zenginleştirme Kokteyl ve RosetteSep Yoğunluk Orta kullanarak, üreticinin talimatlarına göre insan kanı örnekleri T hücreleri arındırmak. Ortaya çıkan hücre nüfusun% 95 CD3 + dinlenme T hücreleri içermelidir. Biz insan T lenfositleri sağlıklı gönüllülerin UC Davis İç Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan protokol uyarınca alınan periferik kan örnekleri arındırmak. </li><li> Izolasyondan sonra,% 10 fetal buzağı serumu,% 2 GlutaMAX-I,% 1 RPMI 1640 ile desteklenmiş, glutamin ve Hepes RPMI-1640 ortamı içeren hücre kültür ortamında 0.5 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu dinlenme T hücreleri tekrar süspansiyon vitamin çözeltisi,% 1 RPMI 1640 amino asitler çözüm,% 1 sodyum piruvat, ve% 0.03 β-mercaptoethanol. </li><li> Place hücre hücre kültürü şişeler içine süspansiyon ve 37 ° C nemlendirilmiş bir inkübatör% 5 CO 2 ile 24 saat kadar önce deneme için korumak. </li></ol> 2. Kayıt Odası hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki kayıt odaları hazırlaması gerekli:) b, a) silikon O-halkalar yuvarlak,% 70 etanol ve distile H 2 O, c ile temizlenmelidir 25 mm lamelleri), Sylgard184 karışık üreticinin talimatlarına göre hazırlanan, ve d) iki adet 60 x 15 mm Petri kapları. </li><li> Yeri ~ 60x15 mm Petri kabında 0,5 mL içine karışık Sylgard184. </li><li> O-ring alt kısmında Sylgard184 kullanarak forseps içine batırın. </li><li> O-ring koyarak başka bir Petri kabı temiz bir yüzey, O-ring kenarına aşırı Sylgard184 çıkarın. </li><li> Halka lamel üzerine yerleştirin ve aşağı doğru bastırın. </li><li> 85 ° C 40-60 dk ya Sylgard184 kadar polimerize odaları ısıtarak Sylgard184 Cure. </li><li> Kayıt odaları tozsuz bir kapta saklayın. </li></ol> 3. Patch Pipetler hazırlanması <ol><li> Deney günü, cam kapiller ve bir pipet çektirmenin kullanarak bir ~ 2-mikron ucu çapı pipetler çekin. Biz filament (1.5 mm ve ID: 1.10 mm OD) ile borosilikat tüp kullanın. Tozsuz bir yerde saklayın pipetler. </li><li> Standart bir prosedür 9 göre Sylgard184 veya HIPEC R6101 Semiconductor Koruyucu Kaplama Coat pipet ipuçları. </li><li> Deneyden önce hafifçe pipetler yangın lehçe. </li></ol> 4. Patch Kelepçe Kurulum Hazırlığı <ol><li> Patch-klemp amplifikatör kontrol yazılımı gigaseal oluşumu için makroları yapılandırma ve kaydedin. Biz Windows XP ve veri toplama için nabız yazılım tarafından desteklenen bir EPC-10 amplifikatör kullanır. EPC-10 kılavuzuna göre, "hücre" ve "tam hücreli" makrolar "set-up" ayarlayın ve tüm deneyler için bunları kullanmak. </li><li> Deneme öncesinde banyo çözümleri ve Tablo 1'de yer alan pipet çözümleri hazırlayın ve 1 hafta kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Kimyasallar </td><td colspan="3"> Banyo Çözümleri (mM) </td><td> Pipet Çözümleri (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-spartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tam hücreli Carc mevcut kayıtları için çözümler. Bütün kimyasallar Sigma-Aldrich, St Louis, MO satın alınmıştır. <ol start="3"><li> Yama pipet çözüm ve her banyo çözümü 10 arasında sıvı birleşme potansiyelleri (LJ) belirleyin. LJ değeri satın alma yazılımı kullanarak uygun bir yere kaydedin. Örneğin, Darbe programı "Amplifikatör" penceresinde "LJ" kontrol LJ değerini yerleştirin. </li><li> Şekil 1'de gösterildiği gibi deneyler önce satın alma yazılımı uygun yerde stimülasyon protokolleri, yapılandırma ve kaydedin. Darbe programında, "Darbe Üretimi" penceresinde satın alma protokolü ayarlayın. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Uyarım protokolü -120 süresi 50 ms +100 mV Gerilim rampası her 0.2 - 2 (5 - 0,5 Hz) uygulanır. Rampaları arasındaki Holding potansiyel (V s) +30 mV korunur. </li></ol> 5. Mikroskop Sahne Montaj Hücreler <ol><li> Hücreleri kaplama önce sonra ~ 20 dakika ve yıkama ve H 2 O ile Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS), poli-L-lizin ile Coat kayıt odaları . </li><li> 37 odası ve 20 dakika boyunca inkübe 0.2-0.5 x10 6 hücre içeren hücre süspansiyonu Plaka 500 mcL ° C </li><li> Bir oda sahibinin bağlı hücreleri ile kayıt odasında sabitleyin. Biz özel yapılmış bir odasının taban lamel alt destekler tutucu, lamel üst karşı üst kısmı hafifçe presler. </li><li> Inverted mikroskop sahnede oda sahibinin yerleştirin. </li><li> Iletilen ışık hücreleri üzerinde odaklanın. Biz 40X immersiyon yağı hedefi kullanın. </li><li> Ag / AgCl referans elektrot banyo içine yerleştirin. </li><li> Multibarrel, yerçekimine bağlı perfüzyon sistemi hizalayın. Girişinin tüpünün ucu, 45 derecelik bir açıyla görüş alanı lamel yakın yerleştirilmelidir. </li><li> Girişi tüp ucu karşısında emme borusu yerleştirin. </li><li> Odasına serpmek fosfat tamponlu salin (PBS) veya HBSS hücre kültürü medya ve gevşek bağlı hücreleri yıkayacak. </li></ol> 6. Kerek Kanal Kayıt Akımlar <ol><li> Lamel sıkıca bağlı bir hücre. Biz genellikle pürüzsüz bir dış yüzeye sahip ortalama büyüklükteki bir yuvarlak hücre seçin. </li><li> Ca 2 +-free, 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm SERCA pompa engellemek için 8-10 dakika süreyle 0.5-1 mcM thapsigargin içeren # 1 (Tablo 1) ile kayıt odasında serpmek. Biz mağaza gigaseal oluşumu öncesinde tüketmek için bu adımı gerçekleştirmeniz. </li><li> Eppendorf Microloader ve P-20 pipeti kullanarak, yama pipet pipet çözüm (Tablo 1) ile doldurun ve amplifikatör headstage pipet tutucu içine yama pipet yerleştirin. Ca 2 + şelasyon BAPTA pasif mağaza tüketmek ve Ca 2 +-bağımlı Kerek kanal inaktivasyon azaltmak için pipet çözümü yer almaktadır. </li><li> Banyo yama pipet içine girmeden önce küçük bir miktar pozitif basınç (H 2 O ~ 3 inç) uygulayın. Biz bir yama pipet içinde pozitif veya negatif basınç oluşturmak için basınçlı hava ve vakum hatları bağlı bir ölçüye göre basınç emme aygıtı kullanın. </li><li> Mikroskop üzerinden görsel kontrol altında banyoya yama pipet indirin. "Osiloskop" penceresinde, geçerli bir pipet akan göreceksiniz. Geçerli genliği bir adım gibi değişiklik, önceden ayarlanmış makro tarafından uygulanan küçük bir genlik gerilim darbesi (test pulse) tarafından indüklenen olmalıdır. Şu anda, pipet direnç değeri belirlemek mümkün olmalıdır. Bizim pipetler direnç genellikle M 5-6. </li><li> Pipet ve referans elektrot arasında oluşturulan "offset" potansiyel düzeltin. </li><li> Hücre zarının dokunana kadar mikroskop üzerinden görsel denetimi altında, yakın hücreye pipet getirmek. </li><li> Yama pipet içinde negatif basınç (H 2 O, 20-40 inç) uygulayın. </li><li> "Osiloskop" penceresinde gigaseal oluşumu izleyin. Test darbe&gt; 5 GΩ pipet direnci artar, azalır ve değeri ile indüklenen akımın genliği, göreceksiniz. Genellikle fe içinde gigaseal formlarıw saniye, ama istikrarlı bir gigaseal elde etmek için 1-2 dakika sürebilir. </li><li> Pipet kapasitans ("C-Hızlı") giderin. </li><li> 20 cc şırınga kullanarak ek negatif basınç uygulayarak yama membran kırın. </li><li> +30 MV tutma potansiyeli ayarlayın. Olumlu bir tutma potansiyeli kalsiyum-bağımlı Kerek kanal inaktivasyon önlemeye yardımcı olur. </li><li> ("C-yavaş"), hücre zarının kapasitans telafi C-yavaş değeri kaydetmek veya kayıt. </li><li> "R" erişim direnç değerini kontrol edin. Deneylerde, Ar-ler genellikle M 7-20. </li><li> (Şekil 1), Ca 2 + 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm # 1 0,5 Hz frekans ile gerilim rampaları bir dizi uygulamaya başlayın . Bu çözüm, Mg 2 + Kerek kanalları yoksul geçirgenliği nedeniyle "kaçak" akım ile karşılaştırıldığında Kerek akım yok denecek kadar küçük. Kaydedin ve "kaçak" akımları olarak gelecekteki analizlerde banyo çözüm # 1 kaydedilen mevcut izleri kullanabilirsiniz. -100 MV "kaçak" geçerli mutlak genlik 5 pA eşit veya daha az olmalıdır. Hücreli "sızdıran" ise, yeni bir yama pipet ve yeni bir hücre kullanarak üzerinde deney ve başlangıç ​​durdurun. </li><li> Kerek kanalları (I Ca-Kerek) ile Ca 2 + cari kayıt için perfüzyon vanaları geçiş Ca 2 + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm # 1 20 mM Ca 2 + içeren banyo çözüm # 2 (Tablo 1) ile değiştirin. Bu Ca 2 + Kerek kanallar üzerinden akış sağlar ve içe doğru bir akım üretmek. "Osiloskop" penceresinde, içsel ben Ca-Kerek (Şekil 2) giderilmesi gelişimini göreceksiniz. Negatif voltaj seviyelerinde geçerli genliği, Ca 2 +-bağımlı potansiyasyonu Kerek akımı nedeniyle yaklaşık 1 dakika artmaya devam edecek . </li><li> Kerek kanallar aracılığıyla geçici Na + cari kayıt için gerekli olan 5 Hz gerilim rampaları ile stimülasyon frekans artırın. </li><li> 20 mM değiştirin Ca 2 +-perfüzyon vanaları geçiş içeren banyo çözüm # 2 Na +-kalsiyum katyon içeren ücretsiz bir çözüm # 3 (Tablo 1). "Osiloskop" penceresinde, içsel Na giderilmesi büyük genlik geçici bir gelişme göreceksiniz + Akım Kerek kanalları (I Na-Kerek; Şekil 2) ile. </li><li> Bir 20 mM Ca 2 "kaçak" geçerli kaydetmek için deney sonunda 1-5 mcM La 3 + + içeren banyo çözümü içeren # 2 başvurabilir. Ancak, zaman içinde "kaçak" güncel değişiklikler nedeniyle bu yaklaşım yararlı vermedi ve bu deney sonunda daha büyük veya daha küçük olabilir. Ca 2 kaydedilen cari + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren bir "kaçak" akım olarak deney başında banyo çözüm # 1 almayı tercih </li><li> Daha fazla analiz için kaydedilen akım izleri kaydedin. </li></ol> 7. Veri Analizi <ol><li> Analiz yazılımı içine kaydedilen kayıtları almak. Biz analiz için Darbe programı kullanabilirsiniz. </li><li> Gerilim rampaların başında ve sonunda mevcut genlikleri ölçün. Biz genellikle, -100 mV ve 100 mV Darbe programı "Osiloskop" penceresinde imleçler çiftleri kullanarak mevcut genlikleri ölçer. </li><li> İhracat, mevcut genlikleri değerleri daha fazla analiz ve grafik sunumu için bir grafik programı içine. Biz Kökeni Bilimsel Grafik ve Analiz Yazılımı, sürüm 7 kullanın. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Dinlenme insan T hücre Kerek akımları (A), -100 mV (dolu daireler) ve 100 mV (açık daireler) tüm hücre voltaj-klemp yapılandırma kaydedilen Kerek akımların Zaman kursu . Gigaseal oluşumuna önce, hücre Ca 2 ~ 10 dakika için preinkübe + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözümü # 1 - 0.5 mcM thapsigargin içeren Break-sonra, banyo çözümleri sırayla şu şekilde uygulanmıştır: Ca 2 + 3 mM 2 Mg, Ca 2 + içeren banyo çözümü # 2, 20 mM tarafından takip + içeren banyo çözümü # 1 (0 Ca + Mg 3 ), (20 Ca), banyo çözüm # 2 (20 Ca) tarafından takip kalsiyum katyon-banyo çözümü # 3 (DVF) izledi. Hücre Şekil 1'de gösterildiği gibi voltaj rampaları bir dizi ile uyarıldı. Rampa banyo çözüm # 3 (DVF) ve diğer tüm çözümler 0,5 Hz frekans 5 Hz. 20 mM Ca 2 + içeren banyo çözümü # 2 ve Na-Kerek hızlı geçici kalkınma DVF banyo çözüm # 3 uygulamadan sonra yavaş bir gelişme Not I Ca-Kerek . (B), Temsilci akım izleri + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm # 1 (Ca 2 gerilim rampaları sırasında kaydedilen"Kaçak"), 20 mM Ca 2 + içeren banyo çözüm # 2 (20 Ca) ve banyo çözümü # 3 (DVF). (C, D), Ca-Kerek (C) ve I Na-Kerek (D) Akım-gerilim ilişkileri voltaj rampaları sırasında 20 mM Ca 2 + içeren banyo kaydedildi akımları "kaçak" mevcut çıkarılarak elde edilen Çözüm # 2 (20 Ca) ve banyo çözümü panelinde gösterilen # 3 (DVF) (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Insan T hücrelerinin dinlenme Kerek akımların elektrofizyolojik soruşturma, bu hücrelerin endojen Kerek geçerli genliği küçük hücre boyutunu (dinlenme insan T hücre çapı 5-8 mm aralığında) nedeniyle küçük olduğu için zor bir iştir. Burada, periferik kan mononükleer hücreleri izole dinlenme insan T lenfositleri güvenilir Kerek akımları kaydetmek için bir adım-adım prosedürü sunuyoruz. Bu teknoloji bize daha normal ve patolojik immün hücre yanıtlarını doğasını anlamak için dinlenme T hücreleri Kerek kanal fizyolojisi ve f...

<table><tbody><tr><td>RosetteSep İnsan T Hücresi Zenginleştirme Kokteyli</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Yoğunluk Medyumu</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>glutamin/HEPES içeren RPMI-1640 besiyeri</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X çözelti)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 vitamin çözeltisi (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640 amino asit çözeltisi (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>İnositol trifosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin Hidrobromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Lantan Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 Yarı İletken Koruyucu Kaplama</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 Serisi Yüksek Performanslı Titreşim İzolasyonlu Laboratuvar Masası</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>başlığıyla birlikte EPC 10 patch clamp amplifikatörü</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>40x yağ daldırma objektifli Olympus 1X71 ters mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows Bilgisayar</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse yazılımı</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin Bilimsel Grafik Çizim ve Analiz Yazılımı</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch pipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Filamanlı borosilikat cam (Dış Çap: 1,5 mm ve İç Çap: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Silikon O-ringler </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Lameller 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan t lenfositleri, kalsiyum-film aktive kalsiyum tüm hücre kayıt (kerek) akımlar

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

T lenfositleri, tükenmesi Ca 2 + hücre içi Ca 2 + mağaza, aktivasyonu plasmalemmal Ca 2 + kanallarını açar, Kalsiyum Yayın-Aktif Kalsiyum (Kerek) kanalları olarak adlandırılır . Kerek kanal T hücre proliferasyonu ve gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli rol oynar. T hücreleri anormal Kerek kanal fonksiyonu ağır kombine immün yetmezlik ve otoimmün hastalıklar 1, 2 bağlantılı olmuştur. Insan T hücreleri Kerek kanal fonksiyonu incelenmesi, normal immün yanıtları düzenleyen yeni moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak ve ilgili insan hastalıklarının nedenleri çözmek olabilir. Membran akımlarının Elektrofizyolojik kayıtları, işlevsel kanal özellikler ve bunların yönetmelik en doğru değerlendirme sağlar. Jurkat T hücreleri, bir insan lösemi T hücre hattı Kerek kanal akımlarının Elektrofizyolojik değerlendirme ilk 3 daha 20 yıl önce yapıldı, ancak, normal insan T hücreleri Kerek akım ölçümleri zorlu bir görev olarak durmaktadır. Kan kaynaklı T lenfositleri Jurkat T hücrelerinin daha boyutu çok daha küçük ve bu nedenle, endojen tam hücreli Kerek akımların genliği çok düşük olduğu gerçeği ile normal T hücreleri Kerek kanal akımları kayıt zorluklar ekleniyor. Burada, biz, biz rutin olarak kaydetmek için kullanabileceğiniz Ca 2 + veya Na + insan T hücrelerinin sağlıklı gönüllülerin periferik kandan izole edilen dinlenme Kerek kanalları üzerinden akımlar. Bir adım-adım prosedürü vermek Burada anlatılan yöntemi, Jurkat T hücreleri Kerek akımları kayıt ve insan T hücrelerinin 4-8 aktive için kullanılan usuller kabul edilmiştir .

Biz, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum tam hücreli yama kelepçe kayıt (Kerek) periferik kan mononükleer hücre-kökenli insan T lenfositleri akımları için bir adım-adım protokolü sağlar.

İnsan T lenfositleri, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum Tüm Hücre Kayıt (Kerek) Akımlar

T lenfositlerinde, hücre içi Ca2+ deposunun boşalması, Kalsiyum Salınımıyla Aktive Olan... olarak adlandırılan plazmalemmal Ca2+ kanallarının aktivasyonuna yol açar.

Plazma membranında yer alan kalsiyum salınımıyla aktive olan kalsiyum kanalları veya CRAC kanalları, T hücresi proliferasyonu ve gen ekspresyonunda önemli bir rol oynar; T hücresi reseptörlerinin bir antijenle stimülasyonu, ikinci haberci olan inositol trifosfatın oluşumuna ve inositol trifosfat reseptörleri aracılığıyla depolardan kalsiyum salınımının aktivasyonuna yol açar. Depolardaki kalsiyum konsantrasyonunun azalması, CRAC kanallarının aktivasyonuna ve buna bağlı olarakle sitozol kalsiyum konsantrasyonunun artışına neden olur. T hücrelerindeki CRAC kanalı fonksiyonundaki anomaliler, ağır kombine immün yetmezlik bozuklukları ve otoimmün hastalıklar dahil olmak üzere birçok insan hastalığı ile ilişkilendirilmiştir.Burada, insan T hücrelerinden endojen kalsiyum ve sodyum crack kanalı akımlarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kaydedilmesine olanak tanıyan bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak, depoyu tüketmek için kalsiyum içermeyen hücre dışı solüsyona veya 3 mM magnezyum içeren solüsyona, Sarkoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz inhibitörü olan FSA garin uygulanır.Bu prosedür, çatlak kanallarının magnezyuma karşı düşük geçirgenliği nedeniyle çatlak kanallarını açar ancak

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, T hücrelerinde T hücresi reseptörünün neden olduğu kalsiyum akışını analiz eder. Anti-CD3 antikorları, T hücresi sinyal yollarını aktive ederek Indo-1 boyası ile bağlanan hücre içi kalsiyum iyonlarında bir artışa yol açar. Akış sitometrisinde, kalsiyumsuz durumdan kalsiyuma bağlı duruma bir spektrum kayması, T hücresi reseptörünün neden olduğu kalsiyum akışı ile ilişkilidir.

Kalsiyum İndikatör Boyası Kullanarak T Hücresi Reseptörü ile İndüklenen Kalsiyum Akışının Değerlendirilmesi

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu...

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Presinaptik salım yüz zarında Ca2+ akımlarının kaydedilmesi, Ca2+ girişinin ve nörotransmitter salınımının kesin olarak anlaşılmasının anahtarıdır. Fonksiyonel izole retikülospinal aksonlar veren lamprey omuriliğinin akut bir ayrışmasını sunuyoruz ve bu da bireysel presinaptik terminallerin serbest bırakma yüz zarından doğrudan kayda izin veriyor.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Burada, floresan mikroskobu kullanarak birincil murin ve insan T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları olarak bilinen ilk yerel Ca 2+ sinyallerini çözmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, bağışıklık hücreleri içindeki Ca2+ sinyal yolaklarını inceleyen ve işlevlerini daha da çözen araştırmacılar için değerli bir kaynak görevi görür.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Öğrenin, insan T lenfositlerinde CRAC kanal akımlarını tam hücre yama kelepçesi tekniğiyle nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem, kalsiyum sinyalleşmesini ve T hücre aktivasyonunu anlamak için güvenilir elektrofizyolojik ölçümler sağlar.

İnsan T lenfositleri, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum Tüm Hücre Kayıt (Kerek) Akımlar

Daha fazla video keşfet