Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Bağışıklık hücreleri enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında merkezi sinir sistemine sızar. Histokimyasal yaklaşımlar, sızan hücrelerin yerini belirlemek ve ilişkili patolojiyi analiz etmek için kullanılabilirken, bu teknikler aynı anda kullanılabilecek antikor sayısı ile sınırlıdır. Burada, mononükleer hücrelerin beyin ve omurilik dokularından hızlı bir şekilde izole edilmesi için bir yöntem gösterilmiştir, burada diseke edilen doku ilk önce homojenize edilir.

Daha sonra, bir perol gradyanı kurulur ve santrifüjlemeyi takiben, mononükleer hücreler arayüzden toplanır. Son olarak, hücreler durulanır ve antikorlarla boyanır Akış sitometrisi analizi sayesinde, hematojen hücreler ve sürveyans mikrogliaları ayırt edilir ve hastalık durumları sırasındaki nispi oranları belirlenebilir. Bu tekniğin Aris gradyanı gibi mevcut yöntemlere veya böyle bir histokimyaya göre en büyük avantajı, daha az zaman alıcı olmasıdır.

Bu, aynı anda daha fazla dokuyu işlemenizi sağlar. Gradyan kurulumunu gösteren palino Laboratuvarımdan bir teknisyen Bu protokol için ihtiyaç duyulacak reaktifleri hazırlayın. Beyin başına SIP olarak adlandırılan dört mililitre stok izotonik perol ile başlayarak.

Bunu yapmak için, dokuz kısım perol ile bir kısım 10 kez HBSS ile kalsiyum ve magnezyum olmadan inversiyon ile karıştırılmış birleştirin. Daha sonra, hazırlanan SIP'yi kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir kez HBSS ile karıştırırken çağrı başına% 70 hazırlayın. Daha sonra, dokuyu toplamak için 15 mililitrelik polipropilen konik bir tüpe cole başına% 70'in iki mililitresini dağıtın.

Bu prosedür için, tüm çalışma farelerinin disseke edilmiş beyinlerini ve omuriliklerini buz üzerinde 10 mililitre RPMI içeren beherlere yerleştirin. Daha sonra, dokuyu gevşek bir oturma boyutuna sahip üç mililitre bir kez HBSS içeren yedi veya 15 mililitrelik bir homojenizatöre aktarın. Bir havaneli nazikçe bir hücre süspansiyonu yapar, daha sonra sıkı oturan B boyutunda bir havaneli geçer ve dokuları daha da ayırır.

Doku homojenize edildikten sonra, yedi mililitrelik son hacme RPMI veya bir kez HBSS ekleyin ve perkoko gradyanını ayarlamak için gradyanı ayarlamaya devam edin. Hücre süspansiyonuna üç mililitre SIP ekleyerek başlayın% 30'luk bir son PERCOCO konsantrasyonuna Perol oda sıcaklığında kullanılmalıdır. Soğuk kullanılırsa, hücreler topaklanma eğilimindedir ve hücre ayrımı daha az verimlidir.

Ardından, pipet yardımı ayar yerçekimi modumuzu kullanarak, 10 mililitrelik hücre süspansiyonunu yavaşça %70 SIP'nin üzerine yerleştirin. %70 ve %30'luk çözeltileri karıştırmaktan kaçının. Bu, prosedürün en kritik adımıdır.

%70 ila 30 kavşakta çok net bir düz çizgi görünmelidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, katmanlama sırasında üçüncü ve% 70'lik çözeltiler karışacağı için mücadele edecektir. Bir sonraki adım, arayüzden ödün vermek 18 santigrat derecede 30 dakikalık 500 G santrifüj

Arayüzün bozulmaması için santrifüjün minimum kesinti ile veya hiç ara vermeden durduğundan emin olun. Degradeleri döndürdükten sonra, tüpün üst kısmında kalın ve viskoz bir döküntü tabakası birikmelidir. Bir sonraki katman, bazen döküntü içeren çekirdek katman başına% 30'luk sarımsıdır.

Sonraki, tanımlanmış bir beyaz haleye sahip olması ve mononükleer hücreleri içermesi gereken 70 ila 30 arayüzüdür. Son olarak, tüpün dibinde berrak% 70 perol tabakası bulunur. Herhangi bir arayüz gözlenmezse, hücrelerin verimi muhtemelen çok düşük olacak ve bu da daha fazla analizi son derece zor hale getirecektir.

Bu nedenle, bu noktada, kontaminasyonu azaltmak için taze hücre süspansiyonları gerekebilir. Tüpün üst kısmındaki kalıntı tabakasını dikkatlice çıkarın ve atın. Daha sonra plastik bir pipet kullanarak, çekirdek katman başına üst% 30'dan geçin ve 70 30 interfazın iki ila üç mililitresini toplayın ve sekiz mililitre bir kez HBSS içeren temiz bir konik tüpe aktarın.

Seyreltilmiş arayüzleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın, ardından 18 santigrat derecede 500 GS'de yedi dakika santrifüjleyin. Döndürmenin ardından supenayı çıkarın ve peleti yeniden süspanse edin. Bir mililitre hücre boyama tamponunda, hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir kez daha yıkayın.

Antikor boyaması yapmak için antikor boyamaya devam etmeden önce dört santigrat derecede bir dakika boyunca 10.000 GS'de bir mikro santrifüj kullanarak, peletleri 50 mikrolitre saflaştırılmış anti-US CD 16, CD 32 içinde yeniden süspanse edin, FC bağlanma bölgelerini bloke etmek için hücre boyama tamponunda bir ila 200 oranında seyreltilir. Herhangi bir boyama prosedürüne gelince, tüm antikorların buz üzerinde 10 dakika boyunca yeterince titre edilmesi zorunludur. Kuluçka sırasında, iki ila beş mikrolitre hücreyi çıkarın ve bunları bir hemo sitometre kullanarak sayın.

Kombine saf beyin ve omurilik dokuları, fare başına yaklaşık üç ila beş kez 10 ila beş hücre vermelidir. İltihaplı beyinler, toplandıkları zaman noktasına ve hastalık modeline bağlı olarak değişen sayıda enflamatuar hücreye sahip olacaktır CD 16 ve CD 32 ile inkübasyonun ardından, 50 mikrolitre bağışıklık hücresine özgü antikor kokteyli karışımı ekleyin. Bu örnekte kullanılan karışım, CD 45, CD four'a karşı antikorlar içerir ve CD 19 buz üzerinde 30 dakika inkübe eder.

Daha da önemlisi, her antikor önce titre edilmelidir. Optimum seyreltmeyi değerlendirmek için, özel akışınızın lazer ve filtre ayarlarının özelliklerine göre seçilen uygun florokrom kombinasyonlarını kullanın. Sitometre, hücreleri boyadıktan sonra, bir mililitre hücre boyama tamponu ekleyerek ve bir dakika boyunca döndürerek hücre boyama tamponunda yıkayın.

Dönüşü takiben 10.000 Gs'de, sırtüstü ajanı atın, daha sonra analiz için acil akış sitometrik analizi için paletleri 100 ila 200 mikrolitre hücre boyama tamponunda yeniden askıya alın. Reus, hücreleri PBS'de hazırlanan% 2 par formaldehit içinde askıya alır ve gece boyunca dört santigrat derecede saklanır. Burada elde edilen ve FC bloğu ile inkübe edilen mononükleer hücreler, ardından anti CD 45, CD dört ve CD 19 antikorları gösterilmiştir.

Akış sitometrisi ile gösterilen protokole uygun olarak CD 45 boyama, CD 45 yüksek hematojen hücreleri CD 45, DIM sürveyans mikrogliasından güzel bir şekilde ayırır. Bu şekil, deneysel otoimmün ensefalomiyelit geliştirmek için indüklenen bir fareden naif ve iltihaplı bir beyinden izole edilen hücreleri karşılaştırır. CD 45 Y ekseninde bir PC yoğunluğu gösterilir, burada naif beyinde üç farklı popülasyon görselleştirilir.

Çok az sayıda CD 45 yüksek hücre tespit edilir. Genellikle toplam izole edilmiş popülasyonun% 2'sinden az. Buna karşılık, EAE'den etkilenen farelerden alınan beyinler, beyne alınan büyük bir kan hücresi akışı göstermektedir.

CD 11 b, CD dört, CD sekiz vb. gibi diğer hücre yüzeyi belirteçlerinin eklenmesi, CD 45 yüksek popülasyonunun daha fazla karakterizasyonuna izin verir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedüre katılırken, akış sitometrisi ile immün fenotipleme ile bağlantılı histolojik yaklaşımların, CNS inflamatuar infiltratlarının bileşimini tam olarak karakterize etmek için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir.