Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Bağışıklık hücreleri; enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında merkezi sinir sistemine sızar. Sızan hücrelerin konumunu belirlemek ve ilişkili patolojiyi analiz etmek için histokimyasal yaklaşımlar kullanılabilse de, bu teknikler aynı anda kullanılabilecek antikor sayısı ile sınırlıdır. Burada, önce diseke edilen dokunun homojenize edildiği, beyin ve omurilik dokularından mononükleer hücrelerin hızlı izolasyonuna yönelik bir yöntem gösterilmektedir.

Ardından, bir Percoll gradyanı hazırlanır ve santrifüjleme sonrası mononükleer hücreler ara yüzeyden toplanır. Son olarak, hücreler durulanır ve antikorlarla boyanır. Akış sitometrisi analizi aracılığıyla hematojen hücreler ve gözetleme mikrogliaları ayırt edilir ve hastalık durumlarındaki göreceli oranları belirlenebilir. Bu tekniğin, Aris gradyanı veya histokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az zaman almasıdır.

Bu, aynı anda daha fazla dokuyu işlemenize olanak tanır. Gradyan kurulumunu laboratuvarımdan bir teknisyen gösterecektir. Bu protokol için gerekli olacak reaktifleri hazırlayın. Beyn başına SIP olarak adlandırılan dört mililitre stok izotonik perol ile başlayın.

Bunu yapmak için, dokuz kısım perol ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 kat konsantrasyonlu HBSS'yi bir kısım oranında ekleyerek ters çevirme yoluyla karıştırın. Ardından, hazırlanan SIP'yi kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir kat konsantrasyonlu HBSS ile karıştırarak %70'lik per kol hazırlayın. Daha sonra, doku toplamak için 15 mililitrelik polipropilen konik tüpe iki mililitre %70'lik per kol aktarın.

Bu prosedür için, tüm çalışma farelerinin diseke edilmiş beyinlerini ve spinal kordlarını, buz üzerinde 10 mililitre RPMI içeren beherlere yerleştirin. Ardından, dokuları üç mililitre 1x HBSS içeren, gevşek geçmeli B boyutunda bir havanla yedi veya 15 mililitrelik bir homogenizer'a aktarın. Bir havanla nazikçe hücre süspansiyonu hazırlayın, ardından sıkı geçmeli B boyutunda bir havana geçerek dokuları daha fazla ayrıştırın.

Doku homojenize edildikten sonra, toplam hacim yedi mililitre olacak şekilde RPMI veya bir kat HBSS ekleyin ve PERCOCO gradyanını oluşturma aşamasına geçin. Hücre süspansiyonuna, nihai PERCOCO konsantrasyonu %30 olacak şekilde üç mililitre SIP ekleyerek başlayın. Perkolun oda sıcaklığında kullanılması gerektiğini unutmayın. Soğuk kullanılırsa hücreler kümelenme eğilimi gösterir ve hücre ayırımı daha az verimli olur.

Ardından, pipet yardımcısını yer çekimi moduna ayarlayarak, 10 mililitre hücre süspansiyonunu yavaşça %70 SIP'in üzerine katmanlar halinde ekleyin. %70 ve %30'luk çözeltilerin karışmasını önleyin. Bu, prosedürün en kritik adımıdır.

70% ve 30% bağlantı noktasında çok net, düz bir hat görünmelidir. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, katmanlama sırasında üçüncü ve 70% çözeltilerin karışması nedeniyle zorluk yaşarlar. Bir sonraki adımda, ara yüzü stabilize etmek için 18 °C'de 500 G'de 30 dakika santrifüjleyin.

Arayüzün bozulmaması için santrifüjün minimum frenle veya frenlemeden duracağından emin olun. Gradyanlar santrifüj edildikten sonra, tüpün üst kısmında kalın ve viskoz bir debris tabakası birikmelidir. Bir sonraki tabaka, bazen debris içeren sarımsı %30 Percoll tabakasıdır.

Sırada, tanımlanmış beyaz bir hale şeklinde görülmesi gereken ve mononükleer hücreleri içeren 70 ile 30 arasındaki ara yüzey yer alır. Son olarak, tüpün dibinde şeffaf %70'lik Percoll tabakası bulunur. Eğer herhangi bir ara yüzey gözlemlenmezse, hücre verimi muhtemelen çok düşük olacaktır ve bu durum ileri analizleri oldukça zorlaştıracaktır.

Bu nedenle, bu aşamada kontaminasyonu azaltmak için taze hücre süspansiyonları gerekebilir. Tüpün üst kısmındaki debris tabakasını dikkatlice çıkarın ve atın. Ardından, plastik bir pipet kullanarak üstteki %30'luk katmanı geçip 70 30 interfazından iki ila üç mililitre toplayın ve bunu sekiz mililitre 1x HBSS içeren temiz bir konik tüpe aktarın.

Seyreltilmiş arayüzleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın, ardından 18 °C'de 500 g'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatantı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1 mL hücre boyama tamponu içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir kez daha yıkayın.

Antikor boyamasına geçmeden önce, pelletleri FC bağlama bölgelerini bloke etmek için hücre boyama tamponunda 1/200 oranında seyreltilmiş 50 µL saflaştırılmış anti-US CD 16, CD 32 içerisinde yeniden süspande edin ve ardından 4 °C'de, 10.000 g'de bir dakika boyunca mikro santrifüjden geçirin. Herhangi bir boyama prosedüründe olduğu gibi, tüm antikorların yeterince titre edilmesi zorunludur; buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, 2 ila 5 µL hücre alın ve bir hemositometre kullanarak bunları sayın.

Kombine naif beyin ve spinal kord dokuları, fare başına yaklaşık üç ila beş çarpı 10 üzeri beş hücre sağlamalıdır. İnflame beyinler, toplandıkları zaman noktasına ve hastalık modeline bağlı olarak değişen sayılarda inflamatuar hücrelere sahip olacaktır. CD 16 ve CD 32 ile inkübasyonun ardından, 50 µL immün hücreye özgü antikor kokteyl karışımı ekleyin. Bu örnekte kullanılan karışım CD 45, CD 4 ve CD 19 antikorlarını içermektedir; 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Önemle belirtmek gerekir ki, her antikor öncelikle titre edilmelidir. Optimal dilüsyonu değerlendirmek için, kullandığınız akış sitometresinin lazer ve filtre ayarlarının kapasitelerine göre seçilmiş uygun florokrom kombinasyonlarını kullanın. Hücreleri boyadıktan sonra, bir mililitre hücre boyama tamponu ekleyip bir dakika boyunca santrifüj ederek hücreleri hücre boyama tamponunda yıkayın.

Santrifüj sonrası 10,000 G'de, süpernatantı atın ve ardından peletleri, anlık veya sonraki analizler için yapılacak akış sitometrik analiz amacıyla 100 ila 200 µL hücre boyama tamponunda yeniden süspande edin. Hücreleri PBS içinde hazırlanan %2 paraformaldehid ile yeniden süspande edin ve dört °C'de gece boyunca saklayın. Burada, elde edilen ve önce FC blok, ardından anti-CD45, CD4 ve CD19 antikorları ile inkübe edilen mononükleer hücreler gösterilmektedir.

Akış sitometrisi ile gösterilen protokole uygun olarak, CD 45 boyaması, CD 45 yüksek hematojen hücreleri, CD 45 DIM gözetleyici mikroglialardan başarılı bir şekilde ayırır. Bu şekil, naif bir beyinden ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit gelişmesi sağlanan bir fareyle elde edilen inflamasyonlu bir beyinden izole edilen hücreleri karşılaştırmaktadır. Y ekseninde CD 45 APC yoğunluğu gösterilmiş olup naif beyinde üç farklı popülasyon görselleştirilmiştir.

Çok az sayıda CD 45 yüksek hücre tespit edilir. Genellikle toplam izole popülasyonun %2'sinden azdır. Buna karşılık, EAE etkilenmiş farelerin beyinleri, beyne göç eden kan hücrelerinin masif bir akışını gösterir.

CD 11 b, CD 4, CD 8 ve benzeri diğer hücre yüzey belirteçlerinin eklenmesi, CD 45 high popülasyonunun daha detaylı karakterizasyonuna olanak tanır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç ila dört saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, CNS inflamatuar infiltratlarının kompozisyonunu tam olarak karakterize etmek için akış sitometrisi ile immün fenotiplemenin histolojik yaklaşımlarla birlikte kullanılmasının kritik olduğunu unutmamak önemlidir.