Name: Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Öğrenin, fare beyin ve omurilik dokularından Percoll gradyanı kullanarak mononükleer hücre izolasyonu yapmayı. Bu yöntem, akış sitometrisi ile immün hücre fenotiplemesine olanak tanır ve sinir sistemi hastalıklarındaki immün infiltrasyonu karakterize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz Derneği (TA AEC 3021-A1 / T) ve University of Texas at San Antonio tarafından desteklenmiştir.

Reaktiflerin hazırlanması Ca olmadan bir bölümünü 10X HBSS Percoll 9 parça karıştırılarak stok izotonik Percoll (SIP), beyin başına 4 ml, hazırlama + + ve Mg + +. 1X HBSS% 70 olmadan SIP hazırlayın Ca + + ve Mg + +, 2 ml, 15 ml polipropilen konik tüp boşaltılan beyin başına. Not: Percoll oda sıcaklığında kullanılması gerektiğini tavsiye edilir, soğuk kullanılması halinde, hücreler gelme eğilimindedirler ve hücre ayırma, daha az verimli. Doku toplama ve homojenizasyon Buz 1X HBSS ile sol ventrikül ile fareler ve serpmek anestezisi. Beyin ve omurilik inceleyin ve fenol kırmızısı kadar tüm fareler kurban olmadan RPMI korumak. 7 veya 15 ml Dounce homojenizatör 3 ml RPMI içeren Yeri dokular, nazikçe, dokulara daha fazla ayırmak tigh uydurma havaneli (B boyutu) tarafından takip gevşek havaneli (A boyutu) ile bir hücre süspansiyonu olun. RPMI hücre süspansiyonları ile 7 ml hacmi tamamlayın. Gradient kurdu Final% 30 SIP yapmak için SIP 3 ml hücre süspansiyonu Yavaş yavaş tabaka,% 70 SIP üstünde 10 ml hücre süspansiyonu. Bu prosedürün en kritik adım,% 70 karıştırma ve% 30 çözümleri kaçınarak çekim modunda bir pipet yardımı kullanın. Çok net bir düz hat 70% -30% kavşakta görünür olmalıdır. 500G 18 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin Santrifüj interfaz rahatsız değildir, böylece az ya da hiç fren duracaktır emin olun. Bir transfer pipetlemeyin kullanarak, yavaşça tüpün üst katman enkaz kaldırmak ve 8 ml 1X HBSS içeren temiz bir konik tüp içine 70% -30% interfaz 2.0-3.0 ml toplamak. Interfaz içeren Percoll yaklaşık üç kat sulandırılmış olduğundan emin olun, 18 500G inversiyon ve centrifugre 7 dk birkaç kez karıştırın ° C. Yeniden süspanse hücre boyama tampon 1 ml pelet ve 1.5 ml tüp aktarmak ve bir mikro-4 10.000 G 1 dak ° C santrifüj kullanarak bir kez daha yıkayın Antikor boyama Antimouse CD16/CD32 saflaştırılmış 50 ul yeniden süspanse pelet Fc'yi siteleri engellemek için hücre boyama tampon 1:200 seyreltilmiş. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Antikor kokteyl mix ve inkübe 30 dakika buz üzerinde 50 ul ekleyin. Her antikor ilk en iyi seyreltme değerlendirmek için titre edilmelidir. , Lazer ve belirli bir akış sitometresi filtre ayarları yeteneklerine göre seçilen uygun florokrom kombinasyonları kullanın. Hücre boyama tampon 100-200 ul hücreleri hücre boyama tampon, tekrar süspansiyon pelet yıkayın ve sitometresinin hemen analiz, ya da alternatif PBS içinde hazırlanan% 2 paraformaldehid (PFA) yeniden süspanse hücreleri, 4 ve üzerinde gece saklanan olabilir ° C . Temsilcisi Sonuçlar: Gradyanlar iplik sonra, 70% -30% interfaz tanımlanmış bir beyaz hale olmalıdır ve naif bir fare kurtarıldı hücrelerin kantitatif başına 3-5 x10 5 fare hücreleri (beyin + omurilik) boyun eğmek zorundadır. Iltihaplı beyin inflamatuar hücrelerin MSS hakaret ya da hastalık modeli (Şekil 1) göre sayıları değişen olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 pik hastalığı Naive ve EAE-beyin hücreleri, mononükleer izolasyonu. Beyin hücreleri süspansiyonlar süreksiz% 70 /% 30 Percoll gradyanlar içinde ayrıldı. Hücreler boyanmış, buz üzerinde 30 dakika boyunca anti-CD45 antikorları takip Fc blok ile inkübe edildi. Hücreler hücre boyama tampon durulanır, ve bir LSR-II% 2 PFA önceden satın alma sabit. Üç farklı popülasyonlar görüntülenmiştir Y-ekseni, CD45 yoğunluğu ölçülür. CD45 hi infiltre hücrelerin bağışıklık fenotipi ileri karakterizasyonu ek antikorlar kullanılarak uygulanır ve daha sonra flow sitometri ile analiz edilir.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

1-3 birkaç on yıl için, normal ve iltihaplı fare dokulardan MSS lökosit hücre yüzey belirteçlerinin analizi kullanılmıştır . İzolasyon protokolleri yoğunluğu santrifüj 4 mikroglia ve lökositlerin ayrılık dayanır. Burada izole MSS lökosit süreksiz Percoll gradyanlar kullanarak hızlı ve etkin bir yöntem açıklanmaktadır. , CD4, CD8, CD11b, CD19, vb gibi çeşitli antikorlar ile boyanarak hücre izolasyonu sonra, as-ama-CD45 sınırlı değil, belirli bir patoloji indüksiyon üzerine MSS sızmak bağışıklık popü...

Doku homojenizasyon ve Degradeler <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> Kalsiyum ve Magnezyum olmadan 10X Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi (Gibco) </li><li> Fenol kırmızısı RPMI Orta olmadan 1640, (Gibco) </li><li> 7-ml veya 15 ml Dounce Doku Değirmenleri (VWR) </li></ul> Flow sitometri <ul><li> Hücre Boyama Tampon (Biolegend) </li><li> Saf Rat Anti-CD16/CD32 Fare (Mouse BD Fc Blok), BD Pharmingen </li><li> Hemasitometre (Fisher) </li><li> Anti-fare CD45 (klon 30-F11), CD4 (klon RM4-5), CD19 (klon 6D5), BioLegend </li><li> Kalsiyum ve Magnezyum olmadan 10X Fosfat Tamponlu Salin (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldehit (Sigma Aldrich) </li><li> Flow sitometri analizi ile yapılan bir LSR II (BD Biosciences) </li></ul>

beyin ve omurilik mononükleer hücreleri İzolasyon percoll degradeler

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

İzolasyon, enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında santral sinir sistemi (MSS) sızmak bağışıklık hücreleri, sık sık fenotip ve efektör fonksiyonları tanımlamak için gereklidir. Histokimyasal yaklaşımlar infiltre hücrelerin yerini belirlemek ve patoloji ilişkili MSS analiz etmek için enstrümantal. Ancak, in-situ histokimyası ve immunofluorescent boyama teknikleri belirli bir doku immün hücre alt tiplerinin karakterize etmek için bir kez kullanılabilir antikor sayısı ile sınırlıdır. Bu nedenle, bağışıklık fenotipleme flow sitometri ile birlikte histolojik yaklaşımlar tamamen yerel MSS infiltrasyon kompozisyon karakterize etmek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, süreksiz Percoll gradyanları üzerinde MSS hücresel süspansiyonlar ayrılması dayanmaktadır. Mevcut makalede, verimli, flow sitometri ile tek bir örnek, çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının belirlenmesi için etkin bir şekilde kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.

Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında merkezi sinir sistemine (MSS) infiltre olan immün hücrelerin izolasyonu genellikle gereklidir ...

Bağışıklık hücreleri; enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında merkezi sinir sistemine sızar. Sızan hücrelerin konumunu belirlemek ve ilişkili patolojiyi analiz etmek için histokimyasal yaklaşımlar kullanılabilse de, bu teknikler aynı anda kullanılabilecek antikor sayısı ile sınırlıdır. Burada, önce diseke edilen dokunun homojenize edildiği, beyin ve omurilik dokularından mononükleer hücrelerin hızlı izolasyonuna yönelik bir yöntem gösterilmektedir.Ardından, bir Percoll gradyanı hazırlanır ve santrifüjleme sonrası mononükleer hücreler ara yüzeyden toplanır. Son olarak, hücreler durulanır ve antikorlarla boyanır. Akış sitometrisi analizi aracılığıyla hematojen hücreler ve gözetleme mikrogliaları ayırt edilir ve hastalık durumlarındaki göreceli oranları belirlenebilir. Bu tekniğin, Aris gradyanı veya histokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az zaman almasıdır.Bu, aynı anda daha fazla dokuyu işlemenize olanak tanır. Gradyan kurulumunu laboratuvarımdan bir teknisyen gösterecektir. Bu protokol için gerekli olacak reaktifleri hazırlayın. Beyn başına SIP olarak adlandırılan dört mililitre stok izotonik perol ile başlayın.Bunu yapmak için, dokuz kısım perol ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 kat konsantrasyonlu HBSS'yi bir kısım oranında ekleyerek ters çevirme yoluyla karıştırın. Ardından, hazırlanan SIP'yi kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir kat konsantrasyonlu HBSS ile karıştırarak %70'lik per kol hazırlayın. Daha sonra, doku toplamak için 15 mililitrelik polipropilen konik tüpe iki mililitre %70'lik per kol aktarın.Bu prosedür için, tüm çalışma farelerinin diseke edilmiş beyinlerini ve spinal kordlarını, buz üzerinde 10 mililitre RPMI içeren beherlere yerleştirin. Ardından, dokuları üç mililitre 1x HBSS içeren, gevşek geçmeli B boyutunda bir havanla yedi veya 15 mililitrelik bir homogenizer'a aktarın. Bir havanla nazikçe hücre süspansiyonu hazırlayın, ardından sıkı geçmeli B boyutunda bir havana geçerek dokuları daha fazla ayrıştırın.Doku homojenize edildikten sonra, toplam hacim yedi mililitre olacak şekilde RPMI veya bir kat HBSS ekleyin ve PERCOCO gradyanını oluşturma aşamasına geçin. Hücre süspansiyonuna, nihai PERCOCO konsantrasyonu %30 olacak şekilde üç mililitre SIP ekleyerek başlayın. Perkolun oda sıcaklığında kullanılması gerektiğini unutmayın. Soğuk kullanılırsa hücreler kümelenme eğilimi gösterir ve hücre ayırımı daha az verimli olur.Ardından, pipet yardımcısını yer çekimi moduna ayarlayarak, 10 mililitre hücre süspansiyonunu yavaşça %70 SIP'in üzerine katmanlar halinde ekleyin. %70 ve %30'luk çözeltilerin karışmasını önleyin. Bu, prosedürün en kritik adımıdır.70% ve 30% bağlantı noktasında çok net, düz bir hat görünmelidir. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, katmanlama sırasında üçüncü ve 70% çözeltilerin karışması nedeniyle zorluk yaşarlar. Bir sonraki adımda, ara yüzü stabilize etmek için 18 °C'de 500 G'de 30 dakika santrifüjleyin.Arayüzün bozulmaması için santrifüjün minimum frenle veya frenlemeden duracağından emin olun. Gradyanlar santrifüj edildikten sonra, tüpün üst kısmında kalın ve viskoz bir debris tabakası birikmelidir. Bir sonraki tabaka, bazen debris içeren sarımsı %30 Percoll tabakasıdır.Sırada, tanımlanmış beyaz bir hale şeklinde görülmesi gereken ve mononükleer hücreleri içeren 70 ile 30 arasındaki ara yüzey yer alır. Son olarak, tüpün dibinde şeffaf %70'lik Percoll tabakası bulunur. Eğer herhangi bir ara yüzey gözlemlenmezse, hücre verimi muhtemelen çok düşük olacaktır ve bu durum ileri analizleri oldukça zorlaştıracaktır.Bu nedenle, bu aşamada kontaminasyonu azaltmak için taze hücre süspansiyonları gerekebilir. Tüpün üst kısmındaki debris tabakasını dikkatlice çıkarın ve atın. Ardından, plastik bir pipet kullanarak üstteki %30'luk katmanı geçip 70 30 interfazından iki ila üç mililitre toplayın ve bunu sekiz mililitre 1x HBSS içeren temiz bir konik tüpe aktarın.Seyreltilmiş arayüzleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın, ardından 18 °C'de 500 g'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatantı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1 mL hücre boyama tamponu içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir kez daha yıkayın.Antikor boyamasına geçmeden önce, pelletleri FC bağlama bölgelerini bloke etmek için hücre boyama tamponunda 1/200 oranında seyreltilmiş 50 µL saflaştırılmış anti-US CD 16, CD 32 içerisinde yeniden süspande edin ve ardından 4 °C'de, 10.000 g'de bir dakika boyunca mikro santrifüjden geçirin. Herhangi bir boyama prosedüründe olduğu gibi, tüm antikorların yeterince titre edilmesi zorunludur; buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, 2 ila 5 µL hücre alın ve bir hemositometre kullanarak bunları sayın.Kombine naif beyin ve spinal kord dokuları, fare başına yaklaşık üç ila beş çarpı 10 üzeri beş hücre sağlamalıdır. İnflame beyinler, toplandıkları zaman noktasına ve hastalık modeline bağlı olarak değişen sayılarda inflamatuar hücrelere sahip olacaktır. CD 16 ve CD 32 ile inkübasyonun ardından, 50 µL immün hücreye özgü antikor kokteyl karışımı ekleyin. Bu örnekte kullanılan karışım CD 45, CD 4 ve CD 19 antikorlarını içermektedir; 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Önemle belirtmek gerekir ki, her antikor öncelikle titre edilmelidir. Optimal dilüsyonu değerlendirmek için, kullandığınız akış sitometresinin lazer ve filtre ayarlarının kapasitelerine göre seçilmiş uygun florokrom kombinasyonlarını kullanın. Hücreleri boyadıktan sonra, bir mililitre hücre boyama tamponu ekleyip bir dakika boyunca santrifüj ederek hücreleri hücre boyama tamponunda yıkayın.Santrifüj sonrası 10,000 G'de, süpernatantı atın ve ardından peletleri, anlık veya sonraki analizler için yapılacak akış sitometrik analiz amacıyla 100 ila 200 µL hücre boyama tamponunda yeniden süspande edin. Hücreleri PBS içinde hazırlanan %2 paraformaldehid ile yeniden süspande edin ve dört °C'de gece boyunca saklayın. Burada, elde edilen ve önce FC blok, ardından anti-CD45, CD4 ve CD19 antikorları ile inkübe edilen mononükleer hücreler gösterilmektedir.Akış sitometrisi ile gösterilen protokole uygun olarak, CD 45 boyaması, CD 45 yüksek hematojen hücreleri, CD 45 DIM gözetleyici mikroglialardan başarılı bir şekilde ayırır. Bu şekil, naif bir beyinden ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit gelişmesi sağlanan bir fareyle elde edilen inflamasyonlu bir beyinden izole edilen hücreleri karşılaştırmaktadır. Y ekseninde CD 45 APC yoğunluğu gösterilmiş olup naif beyinde üç farklı popülasyon görselleştirilmiştir.Çok az sayıda CD 45 yüksek hücre tespit edilir. Genellikle toplam izole popülasyonun %2'sinden azdır. Buna karşılık, EAE etkilenmiş farelerin beyinleri, beyne göç eden kan hücrelerinin masif bir akışını gösterir.CD 11 b, CD 4, CD 8 ve benzeri diğer hücre yüzey belirteçlerinin eklenmesi, CD 45 high popülasyonunun daha detaylı karakterizasyonuna olanak tanır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç ila dört saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, CNS inflamatuar infiltratlarının kompozisyonunu tam olarak karakterize etmek için akış sitometrisi ile immün fenotiplemenin histolojik yaklaşımlarla birlikte kullanılmasının kritik olduğunu unutmamak önemlidir.

isolation-brain-spinal-cord-mononuclear-cells-using-percoll

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video sıçanlarda deneysel otoimmün ensefalomyelit ile merkezi sinir sistemi mononükleer hücreleri izole etmek için nasıl göstermektedir.

EAE Ratlarda Merkez Sinir Sistemi Mononükleer Hücreleri İzolasyon

Burada izole etmek için bir yöntem ve postnatal fare kültür serebellar granül nöron progenitör hücreleri ve serebellar granül nöronlar sunuyoruz.

Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Bu videoda, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanarak bir farenin beyninden mononükleer hücrelerin izolasyonunu gerçekleştiriyoruz. İzole edilmiş mononükleer hücre süspansiyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Fare Beyninden Mononükleer Hücre İzolasyonu: Beyinde Yerleşik Mononükleer Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Tekniği

Bu videoda, in vitro çalışmalar için yenidoğan bir fareden omurilik nöronlarını izole etmek için adım adım bir protokolü açıklıyoruz.

Omurilik Nöron İzolasyonu: İn Vitro Çalışmalar için Yenidoğan Omurilik Nöronlarını İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyan Prosedürü

Video, tümöre sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak bir fare beyninden izolasyonunu göstermektedir. Bunu, daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplamak için yoğunluk gradyan santrifüjlemesi takip eder.

Murin Beyninden Tümör İçeren Bağışıklık Hücrelerinin İzole Edilmesi

Video, bir murin beyin dokusundan tek hücreli bir bağışıklık hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını göstermektedir. Hücreleri beyin dokusundan serbest bırakmak için enzimatik sindirimi ve ardından tek hücreli süspansiyonu elde etmek için bağışıklık hücrelerini yoğunluklarına göre izole etmek için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi içerir.

Murin Beyin Dokusundan Tek Hücreli Bağışıklık Hücrelerinin Süspansiyonunun Hazırlanması

Bu videoda, yetişkin fare omurilik dokusundan birincil karışık glial hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Protokol, dokunun enzimatik sindirimini ve ardından tek hücreli bir popülasyon elde etmek için kırık hücre zarlarının ve miyelin kalıntılarının çıkarılmasını içerir. Hücreler daha sonra karışık glial hücre büyümesi için optimize edilmiş ortamda kültürlenir.

Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Öğrenin, fare beyin ve omurilik dokularından Percoll gradyanı kullanarak mononükleer hücre izolasyonu yapmayı. Bu yöntem, akış sitometrisi ile immün hücre fenotiplemesine olanak tanır ve sinir sistemi hastalıklarındaki immün infiltrasyonu karakterize eder.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Daha fazla video keşfet