İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Bu prosedürün temel amacı, enfeksiyondan sonraki birkaç saat içinde immün hücreler tarafından prion alımını ve taşınmasını izlemektir. Başlamak için, enfekte beyinden agregatlanmış prion çubuklarını saflaştırın ve florokrom ile işaretleyin; ardından bu prion çubuklarını farelerin periton boşluğuna inoküle edin. İki saat sonra periton ve dalaktan, ayrıca mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerinden hücreleri toplayın. Son olarak, geri kazanılan hücreleri immün fenotipik belirteçlerle boyayın ve PreOn tutulumu açısından analiz edin.

Örneğin, akış sitometrisi sonuçları, prion çubuklarının öncelikle makrofajlar ve dendritik hücreler, ikincil olarak monositler ve üçüncül olarak B hücreleri tarafından tutulduğunu ve taşındığını göstermek için kullanılabilir. Bu deneysel sistem, enfeksiyondan hemen sonra hangi hücrelerin PreOn aldıkları, bunları nereye taşıdıkları ve oraya ne kadar hızlı ulaştıkları gibi temel soruları yanıtlayarak prion rezervuarlarını ve potansiyel terapötik hedefleri aydınlatmak için tasarlanmıştır.

Bu prosedürü, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrenciler Crystal, Mt. ve Brady Michael, PreOn proteinlerini toplamak amacıyla gerçekleştirecekler. 100 miligram PreOn enfekte beyin dokusunu, 900 mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu içerisinde, ticari bir blender ile maksimum hızda bir dakika boyunca homojenize edin; ardından hemen iki dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Protein verimini artırmak için bu işlemi üç kez tekrarlayın.

Homojenatı 3000 Gs'de ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı ayırın ve buz üzerinde saklayın. Peleti bir litre hp içinde yeniden süspande edin ve homojenizasyon ile santrifüjasyon adımlarını tekrarlayın.

Şimdi, snat'ı birleştirin ve 0 °C'de 100,000 GS'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peleti 100 mL TBST içinde yeniden süspande edin.

Bradford Deneyi ile protein konsantrasyonunu tahmin edin ve TBST içindeki protein hacmini mililitre başına beş miligram olacak şekilde ayarlayın. 30 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Tekrar olarak, 0 °C'de 100.000 g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

SNA'yı atın ve pellet'i önce 50 milliliters TBST ile yıkayın. Ardından 100 milliliters TBS ile yıkayın; elde edilen pellet'i %1 sarcas seal ve proteus inhibitor cocktail içeren 100 milliliters 1x PBS içinde yeniden süspanse edin ve 37 degrees Celsius'de 120 dakika boyunca karıştırın. Bir sükroz gradyenti gerçekleştirmek için, numuneyi 900 milliliters 320 millimolar sükroz üzerine katmanlayın ve 60 dakika boyunca santrifüjleyin.

10 °C'de 100.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peleti 10 mL 2,3 M sodyum klorür ve %5 Sarcosyl içerisinde yeniden süspande edin. Ardından örneği, birer dakika aralıklarla, %70 maksimum güçte 40 saniye boyunca beş kez sonikasyona tabi tutun.

Numunenin bir mililitresini eppendorf tüplerine aktarın ve 4 °C'de 13,000 g kuvvetinde 15 dakika santrifüjleyin. Peletleri iki kez TBS ile yıkayın ve stokları -70 °C'de saklayın. Saflaştırılmış PreOn çubuklarından bir tüpü, üretici protokolüne uygun olarak bir flakon DITE 6 49 florokrom kullanarak konjuge edin.

Son olarak, filtre kolonları aracılığıyla santrifüj ederek diyet etiketleme tamponunu PBS ile değiştirin. Kullanıma hazır olana kadar, ışık almayan bir yerde, eksi 70 derece Celsius'ta 20 microliter'lik alikotlar halinde saklayın. Bu bölüm; intraperitonal, prion, inokülasyon ve kullanım öncesinde hemen peritondan, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarından ve dalaktan hücrelerin geri kazanımını kapsayan D loop floresan prion işlemini içermektedir.

PBS ile yıkanmış 1 ila 50 arasındaki fareleri, başparmak ve işaret parmağıyla dorsal boyun kürkünden kavrayarak sabitleyin. Fareyi nazikçe size bakacak şekilde çevirin ve kuyruğunu serçe parmağınızla tutarak kısıtlayın. Fareyi, arka gövdesini başının üzerine kaldırıp hafifçe ters konumda tutarak supine pozisyona getirin.

30 gauge'lik bir insülin şırıngası kullanarak, orta hattın bir santimetre lateraline ve sakroiliak eklemin bir ila iki santimetre anterioruna 100 µL floresan pion çubukları enjekte edin. İğneyi, deriden içeriye 45 derece medial yönde bir santimetre derinliğe kadar yerleştirin; kontrol fareleri için floresan boncukların 1/50'lik dilüsyonunu veya sadece PBS kullanın. Deneysel tasarıma uygun olarak, analizlere başlamak için fareleri belirlenen süre boyunca inkübe edin.

Fareleri, onaylanmış hayvan bakım ve kullanım komitesi protokollerine uygun olarak ötanize edin. 12 ml'lik bir şırınga ve 25 gauge iğne kullanarak periton boşluğuna 10 ml PBS enjekte edin. Fare diseksiyonuna geçmeden önce, fareyi bir dakika boyunca nazikçe boylamsal olarak sallayın.

Fare kürkünün ventral tarafını %70 etanol ile iyice ıslatın. Göğüs kafesinin hemen altındaki orta hattaki deriyi pensle kaldırın ve makasla deri üzerinden küçük bir insizyon yapın. Ardından, deride hem başa hem de kuyruğa doğru üç ila beş santimetre uzunluğunda bir insizyon gerçekleştirin.

Orta hattan yanlara doğru her iki uçtan iki santimetrelik insizyonlar yapın, deriyi geriye çekip iğneleyin ve peritoneal ile torasik boşlukları açığa çıkarın. Aynı şırınga ve 16 gauge iğneyi kullanarak peritonumdan hücre süspansiyonunu geri kazanın. Eksudatı 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerinde muhafaza edin.

Peritoneumu çevreleyen ince şeffaf membranı dikkatlice kesin ve mediastinumu açığa çıkarmak için toraksı geriye doğru katlayın. Şimdi, trakeanın ventral tarafının yakınında, brakiyosefalik artere medialde komşu, timusun hafifçe dorsal ve lateralinde yer alan iki ila dört mediastinal lenf nodunu bulun ve çıkarın. Ardından, bağırsakları posterior abdominal duvara sabitleyen yumuşak beyaz mezenterik dokuya gömülü altı adede kadar mezenterik lenf nodunu bulun ve çıkarın.

Lenf düğümlerini, diseksiyon tamamlanana kadar buz üzerinde bir mililitre PMI 1640 besiyeri içerisinde muhafaza edin. Son olarak, dalağı bulun ve çıkarın. Dalak, farenin sol tarafında, orta hattın hemen lateralinde ve bağırsakların dorsalinde yer alan uzun, koyu kırmızı bir organdır.

Bir mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak lenf düğümlerini, plastik bir petri kabındaki üç mililitre PBS içerisine 40 mikronluk bir süzgeçten geçirerek ezerek presleyin. Süzgeci iki mililitre daha PBS ile durulayın ve toplam beş mililitrelik hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ayrıca, petri kabını beş mililitre daha PBS ile durulayıp aynı tüpe aktarın.

Numuneyi 250 gs'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini yeniden süspande edin. İzole edilen hücreleri 1 ml fax tamponu içerisinde 1,5 ml'lik bir EOR tüpüne aktarın.

Genellikle bu boyama protokolü, iyi tanımlanmış bağışıklık hücresi yüzey belirteçlerine karşı floresan antikorlar kullanılarak immün hücre alt kümelerinin tanımlanması için kullanılabilir; tüm antikorları fax tamponuna ekleyin. Kullanımdan hemen önce hücreleri sayın ve 10⁶ hücreyi ependorf tüplerine paylaştırın, hücreleri santrifüj ederek çöktürün ve endojen FC reseptörlerini bloke etmek için pelletleri bir mililitre fax tamponu ile iki kez yıkayın.

Hücreleri, 100 µL 2 ng/mL sıçan anti-US CD 1632 içerisinde buz üzerinde 20 dakika inkübe edin, ardından hücreleri pelletleyin ve FACS tamponu ile yıkayın. Sonrasında, her örneğe 100 µL 1 ng/mL uygun floresan antikor veya antikorlar ekleyin ve buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Kontrol hücrelerine sadece 100 µL FACS tamponu ekleyin, pelletleyin ve hücreleri FACS tamponu ile iki kez yıkayın.

Hücreleri bir mililitre act tamponu içinde yeniden süspanse edin ve bir dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Alyuvarları liz etmek için hücreleri pelletleyin ve fax tamponu ile yıkayın, ardından hücreleri bir mililitre fax tamponu içinde yeniden süspanse edin. Örnekleri, tipik olarak 405, 488 ve 633 nanometre eksitasyon lazerlerine ve 5 ila 10 floresan emisyon dedektörüne sahip bir akış sitometresinde analiz edin.

Ham prion içeren enfekte beyin homojenatı, prionlar bakımından oldukça zengindir. Saflaştırma süreci; E iki elk beyin homojenatının deterjanla çözünür hale getirilmesini ve ultrasantrifügasyonunu içerir. Ürün proteazdır.

Belirli hücre popülasyonlarının K dirençli faks analizi, antijen sunan hücrelerin iki saat içinde peritona yöneldiğini ve floresan boncuklar ile prion çubuklarını tuttuğunu göstermektedir. Boncuk ve prion ile inoküle edilmiş farelerden alınan hücreler, özellikle monositlerde, dendritik hücrelerde ve makrofajlarda belirgin floresans sergilemiştir.

PreOn taşıyan monositlerin, dendritik hücrelerin ve makrofajların mediastinal lenf nodlarında da bulunduğu tespit edilmiştir. İnokülasyondan iki saat sonra, oral veya mezenterik lenf nodlarında herhangi bir boncuk veya PreOn çubuğu saptanmamıştır. Bu deneyde video; intraperitoneal enjeksiyonlar yapmak amacıyla enfekte beyinden agregatlanmış prion çubuklarını saflaştırmak, lenf nodlarını doğru şekilde tanımlamak ve izole etmek ve son olarak bağışıklık hücrelerini izole edip boyamak için kullanılan çeşitli protokolleri göstermiştir.