Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Bu prosedürün genel amacı, bir motor nöron aksiyon potansiyelinin ve hedef kastaki ilişkili sinaptik yanıtın eş zamanlı elektrofizyolojik kayıtlarını elde etmektir. Bu işlem, öncelikle balığın üst tarafındaki derinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, üzerindeki tüm dorsal kas hücrelerini kaldırarak omuriliği açığa çıkarmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, üstteki yavaş kas tabakasını kaldırarak hedef hızlı kası açığa çıkarmaktır. Prosedürün son adımı, coddle primer veya kap nöronuna akım klempi uygulamak ve hedef iskelet kasına voltaj klempi uygulamaktır. Nihayetinde, motor nörona eş zamanlı akım klempi ve hedef kasa voltaj klempi uygulanarak, motor nöron aksiyon potansiyellerinin tetiklenmesiyle ilişkili kas içi sinaptik yanıtları gösteren sonuçlar elde edilebilir.

LaVar Süper Balığı; eşleşmiş motor nöron iskelet kası kayıtlarını kolaylaştıran bir avantajlar kombinasyonu sunmaktadır; kasın küçük boyutu etkili voltaj klembi uygulanmasına izin verirken, kap motor nöronunun stereotipik özellikleri kolay tanımlama ve erişim sağlar. Şimdi, hem nöron hem de kas için patch clamp kurulumu için gerekli olan prosedürleri adım adım açıklayacağım. Prosedüre başlamadan önce; Banyo solüsyonu, Trica içeren banyo solüsyonu, IDE içeren banyo solüsyonu, nöron internal solüsyonu ve kas internal solüsyonunu içeren beş temel solüsyonu hazırlayın.

Ardından, 72 ila 96 saatlik tek bir zebra balığı larvası toplayın ve trica içeren banyo solüsyonuna yerleştirin. Anestezik maddeye maruz kaldıktan bir dakika sonra balık tepki vermeyecektir. Dokunma testi için balığı plastik bir kabın üzerine yerleştirin ve stereo mikroskop kullanarak çift ağızlı bir jiletle kafasını kesin.

Balığı, sard ile kaplanmış ve bass çözeltisi ile doldurulmuş cam bir kayıt haznesine aktarın. Balığın rostral ucuna yakın bir bölgede, ince bir penset çifti için uygun tutuş sağlayacak bir deri flebi oluşturun. Üstteki deriyi, rostral pimin yakınından ince bir penset çifti ile kavrayarak kaldırın.

Deriyi çıkarmak için yavaşça kuyruk yönünde soyun. Kayıtları etkileyebilecek kas kasılmalarını engellemek için balığı IDE formundaki banyo çözeltisinin 3 mL'si ile 3 ila 5 dakika boyunca işleme tabi tutun. Normal banyo çözeltisi ile beş kez yıkayın.

Tungsten bir iğnenin yan tarafıyla nazikçe kazıyarak, beş ila altı segment üzerindeki kasın yüzeysel tabakasının bir kısmını kaldırın. Elektriksel gürültüyü engellemek için balığı, bir Faraday kafesi içinde yer alan dik bir mikroskoba aktarın. Mikroskop; sabit bir sahne, uzun çalışma mesafeli 40 x objektif ve 0,5 ila dört x arasında zoom özelliğine sahiptir.

Mikroskop, motorlu bir XY öteleme tablası üzerine monte edilmiştir. Yüksek büyütme altında preparasyonu sinir ve kas arasında hareket ettirmek için, diferansiyel girişim kontrastı optiklerinin kullanımı nöronların 0.5 x zoom altında görüntülenmesine yardımcı olur. Üstteki kas dokusunu uzaklaştırmak ve spinal kordu açığa çıkarmak için geniş ağızlı 15 mikronluk bir pipet kullanın.

Üç cc'lik tek kullanımlık bir şırınga aracılığıyla negatif basınç uygulanır ve kas hücreleri tek tek çıkarılır. Bu işlem, iskelet kasının beş ila altı dorsal segmenti için tekrarlanır. Hedef olan hızlı iskelet kasını elde etmek için ventral kasın üst iki tabakasını çıkarmak amacıyla aynı geniş ağızlı pipet kullanılır.

Bu işlemle eşleştirilmiş kayıtlar için hazırlık tamamlanır ve mikroskop yakınlaştırması yaklaşık 1,6 x seviyesine çıkarılır. Cap nöronlarını belirlemek için temiz segmentler taranır. Omuriliğin her bir HEMI segmenti, 10 mikron çapında bir adet büyük cap motor nöronu içerir.

Gözyaşı şeklindeki bu soma, segmental sınırın en uç kısmına yakın, spinal Jira'nın hemen altında yüzeysel olarak yer alır. Kayıt için bir kap nöronu seçilir ve ilgili uç segmentin ventral hedef kas alanı bütünlüğü kontrol etmek için taranır. Kayıt için iki patch elektrotu konumlandırılır; biri nöron için, ikincisi ise kas için.

Üst elektrot, sert spinal duranın penetrasyonu için sığ bir konikliğe ve yaklaşık iki mikronluk bir uç açıklığına sahiptir. Alt elektrot ise iskelet kasının düşük dirençli voltaj klemp kaydı için daha dik bir konikliğe sahiptir. Spinal durayı penetre etmek için nöron elektrodunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yerleştirin.

Seçilen cap nöronunun rostral yönde yaklaşık yarım segment ilerisinden, yaklaşık 60 milimetre cıva tutarında hafif ve sürekli bir pozitif basınç uygularken, aksiyel bir sürüş manipülatörü kullanarak elektrodu ilerletin. Elektrot durayı delip geçerken, elektrottan gelen perfüzyon nedeniyle cap nöronu yer değiştirebilir ve bu durum odağın yeniden ayarlanmasını gerektirebilir. Elektrot cap nöronun SOMAsına temas ettiğinde pozitif basınç serbest bırakılır ve bu durum genellikle anında bir giga seal oluşumuyla sonuçlanır.

Ancak, sızdırmazlığın sağlanamadığı bazı durumlarda, hafif bir negatif basınç uygulamak gerekir. Sızdırmazlık oluşumundan sonra, elektrot potansiyeli -80 milivolt'a ayarlanır ve negatif basınç uygulanması hücre membranını yırtar. Kap nöronu, 140 ile 180 mega ohm arasında bir giriş direnci ve +40 milivolt'u aşan bir aksiyon potansiyeli ile karakterize edilir.

Bu durum, aksiyon potansiyeli tetiklenene kadar akım klembi altında kademeli olarak artan depolarizasyon basamakları enjekte edilerek test edilir. Ardından, mikroskop XY motorlu çevirici kullanılarak ventral kasa yönlendirilir. Yüksek büyütme altında, hedef alandan bir hızlı kas hücresi seçilir.

Kas elektrodu, pozitif basınç altında hedef kas hücresine doğru ilerletilir ve basınç bırakıldığında bir giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturur; sodyum kanallarını inaktive etmek için elektrot potansiyeli -50 millivolt değerine ayarlanır. Ardından, hafif vakumlama ile hücre membranı yırtılır. Direncin 100 ila 200 mega ohm seviyesine düşmesi ve büyük kapasitif geçici sinyallerin aniden ortaya çıkması, test çiftine girişin gerçekleştiğini gösterir.

Motor nöron kaydedilirken, bir aksiyon potansiyeli oluşana kadar kademeli olarak artırılan akım enjeksiyonları ile depolarize edilir. Bu noktada, kasla birlikte motor nöronun 1 Hz frekansta stimülasyonuna devam edildiğinde, başarısızlık olmaksızın bir uç plaka akımı oluşmalıdır. Stimülasyon frekansı 100 Hz'e çıkarıldığında, uç plaka akımlarının genliğinde dalgalanmalar meydana gelir ve 10 saniyelik stimülasyon içerisinde fonksiyonel tükenme gerçekleşir.

Genellikle, nöron kaydı bir saate kadar kararlıdır, ancak kas hücreleri seri dirençteki artışla kendini gösteren bir bozulma sergiler. Bu durum gerçekleştiğinde, deney ya sonlandırılır ya da başka bir kas hücreye yama kenetleme uygulanır. Tüm kayıtlar bir saat içinde tamamlanmalıdır.

Bir çift üzerinde uzmanlaşıldıktan sonra, kayıt işlemi bir ila bir buçuk saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca komşu segmentlerde bir veya iki ek çift elde etmek de mümkündür. Tipik bir kayıt günü, iki ila üç çift üretilmesini sağlar.

Eşleşmiş motor nöron iskelet kası kayıtları, nöromüsküler iletimin temel işleyişini incelemek için benzersiz bir fırsat sunar. Motility mutant balık hatları ile birlikte kullanıldığında, nöromüsküler disfonksiyonun kaynağını belirleyebilir ve metastatik sendrom gibi insan hastalıklarının altında yatan mekanizmalara dair yeni bakış açıları sağlayabilir.