Name: Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Öğrenin motor nöron ve hedef iskelet kasından eşzamanlı patch kelepçe kayıtları yapmayı Danio rerio larvalarında. Bu yöntem sinir-kas iletişimini ve sinaptik iletimi incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH (NS-18.205) tarafından finanse edilmektedir.

1. Eşleştirilmiş Kayıtlar Balık hazırlanması <ol><li> Yordama başlamadan önce, dahil beş anahtar teslim çözümler hazırlamak: Banyo Çözüm Tricaine (MS222), Formamid, Nöron İç Çözüm ve kas İç Çözüm Çözüm Banyo Banyo Çözüm. </li><li> Daha sonra, 72 ila 96 saat arasında yaş ve Banyo Çözüm Tricaine ile yer arasında bir tek larva Zebra balığı toplamak. Anestezi maruz kalma bir dakika içinde, balık, dokunmaya karşı cevap vermez. </li><li> Plastik bir tabak balık üstüne yerleştirin ve bir stereomikroskopta kullanarak, çift kenar jilet ile başını kesmek. </li><li> Sylgard ile kaplı ve Banyo Çözümü ile dolu bir cam kayıt odasına balık aktarın. Notokord ile elektrolitik bilenmiş tungsten pimleri takarak her iki ucunda sabitleyin. </li><li> Rostral sonuna yakın, ince forseps bir çifti için yeterli bir kavrama sağlayacak bir iğne ile balık flep oluşturun. Bir çift ince forseps ile rostral pin yakınında sürükleyici örten deri çıkarın. Kaudal yönde yavaş yavaş soyun cilt kaldırmak için. </li><li> Kayıtları ile etkileşebilir kas kasılmaları engellemek için 3-5 dakika Formamid Banyo Çözüm 3 ml ile balık davranın. Normal Banyo Çözümü ile 5 kez yıkayın. 5 ila 6 segmentleri üzerinde yüzeysel kas tabakasının parçası hafifçe tungsten pin tarafı hurdaya çıkarın. </li><li> Elektriksel gürültü kalkan bir Faraday kafesi bulunan dik bir mikroskop balık aktarın. Mikroskop, uzun 4x mesafe 40x objektif ve zoom 0,5, sabit bir sahne ile donatılmıştır. Mikroskop yüksek güç altında sinir ve kas arasındaki hazırlık taşımak için motorize XY çeviri aşamasında üzerine monte edilmiştir. Diferansiyel girişim kontrast optik nöron görselleştirmek için yardımcı olur. </li><li> 0,5 x zoom örten kas altında, kaldırmak ve omurilik ortaya çıkarmak için geniş bir çap 15 mikron pipet kullanın. Negatif basınç, 3 cc tek kullanımlık şırınga ve kas hücreleri ile uygulanan tek tek çıkarılır. Bu prosedür, iskelet kası 5 ila 6 dorsal segmentleri için tekrarlanır. Aynı geniş delik pipet de hedef hızlı iskelet kas elde etmek için karın kas üst iki kat kaldırmak için kullanılır. </li><li> Bu eşleştirilmiş kayıtları için hazırlık tamamlar ve mikroskop zum yaklaşık 1.6x 'e yükselmiştir. </li></ol> 2. Eşleştirilmiş CaP Motor nöron Kayıtlar ve Hedef kas hücreleri <ol><li> Temizlenir segmentleri CaP nöronlar bulmak için taranır. Her omurilik hemi-segment, büyük bir, 10 mikron çapında, PCa motor nöron içerir. Bu gözyaşı şeklindeki soma segmental sınır kaudal en sonuna yakın spinal dura altında yüzeysel olarak yer almaktadır. Bir CaP nöron kayıt için seçilir ve komşu kaudal segmentinde ventral hedef kas bütünlüğünü kontrol etmek için taranır. </li><li> İki kayıt, nöron ve kas için ikinci bir yama elektrotlar yerleştirilir. Üst elektrodun sert spinal dura ve yaklaşık 2 mikron ucu açılış penetrasyon için sığ bir konik vardır. Alt elektrot iskelet kas düşük direnç gerilim kelepçe kayıt için dik konik </li><li> Nöron elektrot spinal dura nüfuz yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yerleştirin, yaklaşık bir yarım seçilen CaP nöron rostral-segment. Avans yaklaşık 60 milimetre cıva nazik bir sürekli pozitif basınç uygulayarak eksenel bir sürücü manipülatör kullanarak elektrot. Elektrot dura delerek geçer gibi, CaP nöron odak yeniden düzenlenmesi gerektiren elektrottan perfüzyon yerinden olabilir. </li><li> Elektrot değdiğinde CaP nöron soma pozitif basınç yayınlandı ve gigaohm mühür hemen oluşumunda genellikle sonuçları. Ancak, bazı durumlarda bir mühür formu başarısız, nazik bir negatif basınç uygulamak için gerekli olur. Mühür kurulmasından sonra, elektrot potansiyeli to-80mV ayarlanabilir ve negatif basınç uygulaması hücre zarı rüptür. CaP nöron 140-180 Mega ohm ve aksiyon potansiyeli, bu artım +40 milivolt bir giriş direnci ile karakterizedir. Bu aksiyon potansiyeli ortaya çıkardı kadar akım pensi altında depolarizan adımları aşamalı olarak artan enjekte edilerek test edilir. </li><li> Daha sonra, mikroskop altında XY motorlu tercümecisi yüksek güç kullanarak ventral kas taşındı. Hızlı bir kas hücre hedef alan seçilir. </li><li> Serbest bırakıldığında, gigaohm mühür formları pozitif basınç altında hedef kas hücresi, kas elektrot doğru ilerletilir. Elektrot potansiyeli -50 milivolt sodyum kanallarını inaktive ayarlanır ve yumuşak emmek altında hücre zarının delinmiş veya yırtılmış. 100 ile 200 Mega-ohm direnç ve büyük kapasitif transientler sinyalleri giriş aniden ortaya bir damla. </li><li> Test etmek içinbir aksiyon potansiyeli ortaya çıkardı kadar eşleştirilmiş kayıt için, motor nöron aşamalı olarak daha büyük akım enjeksiyonu depolarize. Bu noktada bir uç plakası akımı kas anlaşılabilir olmalıdır. Arızasız son plağın akımları 1 Hertz sonuçları motorneuron Devamı stimülasyonu. 100 Hertz uyaran frekansı arttıkça uç plakası akımları genlik dalgalanma ve stimülasyon 10 saniye içinde fonksiyonel tükenmesi tabi. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Tipik olarak, nöron kayıt için bir saat kadar istikrarlı ama kas hücreleri seri direnç bir artış olarak yansır bozulabilir. Bu oluştuğunda deney ya iptal edilir ya da başka bir kas hücresi yama kelepçeli. Tüm kayıtlar bir saat içinde tamamlanmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 motorneuron aksiyon potansiyeli (AP, üst) ve ilgili kas uç plakası mevcut (EPC, alt) Kayıtlar. CaP nöron için aksiyon potansiyeli aşmayı +40 mV ve EPC 1 msn altında sabit bir süre ile üstel bir zaman seyri boyunca 300 μsec ve çürüme içinde yükselmeye etmelidir. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Reçete </td></tr><tr><td> Banyo Çözümü (mM) </td><td> 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 Glikoz, 10 Na-Hepes, pH 7.8 </td></tr><tr><td> Tricaine ile Banyo Çözüm </td><td> Banyo Çözüm içeren% 0.02 tricaine </td></tr><tr><td> Banyo Formamid ile Çözüm </td><td> 2M formamid içeren Banyo Çözüm </td></tr><tr><td> Nöron İç Çözümü (mM) </td><td> 115 K-glukonat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7.2 </td></tr><tr><td> Kas İç Çözüm (mM) </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözümler.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

Biz esas olarak yüksek frekanslı stimülasyon sırasında vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm süreçlerini incelemek için zebrafish eşleştirilmiş kayıtları (Wen ve Brehm, 2005) ile olmuştur. Bu süreç, temel sinaptik bileşenler, nokta mutasyonları nedeniyle tehlikeye motilite mutantlar neyin normal sinaptik iletimi bozulur. Örneğin, mutasyonlar postsinaptik reseptör agrega (Ono ve arkadaşları, 2001, 2002, 2004) ve presinaptik verici sentezi (Wang ve ark, 2008) un koordine yüzme sonucu bozabilir. Eşleştirilmiş kayıtları böylece davranış, genetik ve fizyoloji bağlama, fonksiyonel defekti kaynak kesin bilgi verir. Şimdi daha akıllıca rehberleri kullanarak CaP motor nöronların sinaptik iletim yoluyla geçici ifade yatan süreçleri incelemek mümkün olmalıdır. Bu şekilde dominant negatif ya da mutasyona uğramış genlerin, özellikle bu nöronların ifade ve hem de davranışsal ve elektrofizyolojik sonuçları belirlenen olabilir. CaP soma ajanları ile potansiyel vezikül geri dönüşüm, Clostrodiol toksinler ve kalsiyum tamponlar gibi değiştirebilir diyaliz tüm hücre yapılandırması tarafından sunulan ek bir avantaj sağlar. Soma ve kas arasındaki kısa mesafe nedeniyle, difüzyon kayıtların zaman çerçevesi içinde yapılması gerekir. Bu hazırlık potansiyeli sadece dokundunuz başladı. Ayrıca, bu yaş ve yüzeysel sinaps yerde balık şeffaflık, optik aletler kullanımı (Fetcho ve Higashijima, 2004 Fetcho ve O&#39;Malley, 1997) kolaylaştırır. FM boyalar ve Synaptophluorin (Li ve ark, 2003) gibi genetik göstergeleri kullanarak yaşayan balık endo ve ekzositoz ölçme çok başarılı olmuştur. Ayrıca, floresan konjuge toksinler canlı balık (Ibanez-Tallon ve ark, 2004) görüntüleme için sinaptik proteinlerin etiket kullanılabilir. Bu preparatın basitliği göz önüne alındığında gelecekteki çalışma için büyük umut vaat.

<table><tbody><tr><td>Pnömatik transducer test cihazı</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>0.002 x 3 inch tungsten çubuk</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Uygulama kalınlığı DIC optiklerini etkileyecektir</td></tr></tbody></table>

motor-nöron paired patch kelepçe kayıtlar ve zebra balığı hedef İskelet kası

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef kas aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu her iki hücre tipleri ve yeteneği, görsel olarak morfolojisi ve lokasyon bazında tek segmental CaP motor nöron ayırt etmek için erişilebilirlik doğrudan bir sonucudur. Bu video bir CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir. CaP motor nöron tipi Kimlik boya dolum birinin veya biyofiziksel aksiyon potansiyeli dalga şekli ve hücre giriş direnci gibi özellikleri ile teyit edilir. Motor nöron kayıtları, bir saat, birden fazla farklı hedef kas hücreleri uzun vadeli kayıtları izin rutin son. Motor nöron ateşleme deseni üzerinde kontrol nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim frekans bağımlılığı ölçümleri sağlar. Üniter olaylar büyük bir quantal boyutu ve tüm hücre gerilimi kelepçe tarafından sağlanan düşük gürültü seviyesi sayesinde, tüm kas çözülebilir. Bu özellik sürüm özellikleri, vezikül yanı sıra geri dönüşüm, sinaptik depresyon ve kolaylaştırılması gibi temel sinaptik özellikleri çalışma izin verir. Motor nöron genellikle ekstrasellüler elektrotlar tarafından teşvik eden bu in vivo hazırlık eclipse önceki nöromüsküler model sistemler tarafından sunulan avantajları okudu ve kaslar tüm hücre yama kelepçe için çok büyük. Zebra balığı hazırlık yaklaşımların transgenik hatları, morfolino demonte, farmakolojik müdahale ve in vivo görüntüleme dahil olmak üzere geniş bir yelpazede elektrofizyolojik analizi birleştirerek için uygun. Bu yaklaşımlar, giderek artan sayıda zebrafish mutant hatları tarafından sağlanan nöromüsküler hastalık modelleri ile birleştiğinde, insan nöromüsküler bozukluklar yeni bir anlayış için kapıyı açmak.

Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef iskelet kası aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu video segmental CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebra balıkları, bir spinal motor nöron ile hedef kastan eş zamanlı patch clamp kaydına olanak tanıyan ilk omurgalı model sistemini temsil etmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, bir motor nöron aksiyon potansiyelinin ve hedef kastaki ilişkili sinaptik yanıtın eş zamanlı elektrofizyolojik kayıtlarını elde etmektir. Bu işlem, öncelikle balığın üst tarafındaki derinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, üzerindeki tüm dorsal kas hücrelerini kaldırarak omuriliği açığa çıkarmaktır.Prosedürün üçüncü adımı, üstteki yavaş kas tabakasını kaldırarak hedef hızlı kası açığa çıkarmaktır. Prosedürün son adımı, coddle primer veya kap nöronuna akım klempi uygulamak ve hedef iskelet kasına voltaj klempi uygulamaktır. Nihayetinde, motor nörona eş zamanlı akım klempi ve hedef kasa voltaj klempi uygulanarak, motor nöron aksiyon potansiyellerinin tetiklenmesiyle ilişkili kas içi sinaptik yanıtları gösteren sonuçlar elde edilebilir.LaVar Süper Balığı; eşleşmiş motor nöron iskelet kası kayıtlarını kolaylaştıran bir avantajlar kombinasyonu sunmaktadır; kasın küçük boyutu etkili voltaj klembi uygulanmasına izin verirken, kap motor nöronunun stereotipik özellikleri kolay tanımlama ve erişim sağlar. Şimdi, hem nöron hem de kas için patch clamp kurulumu için gerekli olan prosedürleri adım adım açıklayacağım. Prosedüre başlamadan önce; Banyo solüsyonu, Trica içeren banyo solüsyonu, IDE içeren banyo solüsyonu, nöron internal solüsyonu ve kas internal solüsyonunu içeren beş temel solüsyonu hazırlayın.Ardından, 72 ila 96 saatlik tek bir zebra balığı larvası toplayın ve trica içeren banyo solüsyonuna yerleştirin. Anestezik maddeye maruz kaldıktan bir dakika sonra balık tepki vermeyecektir. Dokunma testi için balığı plastik bir kabın üzerine yerleştirin ve stereo mikroskop kullanarak çift ağızlı bir jiletle kafasını kesin.Balığı, sard ile kaplanmış ve bass çözeltisi ile doldurulmuş cam bir kayıt haznesine aktarın. Balığın rostral ucuna yakın bir bölgede, ince bir penset çifti için uygun tutuş sağlayacak bir deri flebi oluşturun. Üstteki deriyi, rostral pimin yakınından ince bir penset çifti ile kavrayarak kaldırın.Deriyi çıkarmak için yavaşça kuyruk yönünde soyun. Kayıtları etkileyebilecek kas kasılmalarını engellemek için balığı IDE formundaki banyo çözeltisinin 3 mL'si ile 3 ila 5 dakika boyunca işleme tabi tutun. Normal banyo çözeltisi ile beş kez yıkayın.Tungsten bir iğnenin yan tarafıyla nazikçe kazıyarak, beş ila altı segment üzerindeki kasın yüzeysel tabakasının bir kısmını kaldırın. Elektriksel gürültüyü engellemek için balığı, bir Faraday kafesi içinde yer alan dik bir mikroskoba aktarın. Mikroskop; sabit bir sahne, uzun çalışma mesafeli 40 x objektif ve 0,5 ila dört x arasında zoom özelliğine sahiptir.Mikroskop, motorlu bir XY öteleme tablası üzerine monte edilmiştir. Yüksek büyütme altında preparasyonu sinir ve kas arasında hareket ettirmek için, diferansiyel girişim kontrastı optiklerinin kullanımı nöronların 0.5 x zoom altında görüntülenmesine yardımcı olur. Üstteki kas dokusunu uzaklaştırmak ve spinal kordu açığa çıkarmak için geniş ağızlı 15 mikronluk bir pipet kullanın.Üç cc'lik tek kullanımlık bir şırınga aracılığıyla negatif basınç uygulanır ve kas hücreleri tek tek çıkarılır. Bu işlem, iskelet kasının beş ila altı dorsal segmenti için tekrarlanır. Hedef olan hızlı iskelet kasını elde etmek için ventral kasın üst iki tabakasını çıkarmak amacıyla aynı geniş ağızlı pipet kullanılır.Bu işlemle eşleştirilmiş kayıtlar için hazırlık tamamlanır ve mikroskop yakınlaştırması yaklaşık 1,6 x seviyesine çıkarılır. Cap nöronlarını belirlemek için temiz segmentler taranır. Omuriliğin her bir HEMI segmenti, 10 mikron çapında bir adet büyük cap motor nöronu içerir.Gözyaşı şeklindeki bu soma, segmental sınırın en uç kısmına yakın, spinal Jira'nın hemen altında yüzeysel olarak yer alır. Kayıt için bir kap nöronu seçilir ve ilgili uç segmentin ventral hedef kas alanı bütünlüğü kontrol etmek için taranır. Kayıt için iki patch elektrotu konumlandırılır; biri nöron için, ikincisi ise kas için.Üst elektrot, sert spinal duranın penetrasyonu için sığ bir konikliğe ve yaklaşık iki mikronluk bir uç açıklığına sahiptir. Alt elektrot ise iskelet kasının düşük dirençli voltaj klemp kaydı için daha dik bir konikliğe sahiptir. Spinal durayı penetre etmek için nöron elektrodunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yerleştirin.Seçilen cap nöronunun rostral yönde yaklaşık yarım segment ilerisinden, yaklaşık 60 milimetre cıva tutarında hafif ve sürekli bir pozitif basınç uygularken, aksiyel bir sürüş manipülatörü kullanarak elektrodu ilerletin. Elektrot durayı delip geçerken, elektrottan gelen perfüzyon nedeniyle cap nöronu yer değiştirebilir ve bu durum odağın yeniden ayarlanmasını gerektirebilir. Elektrot cap nöronun SOMAsına temas ettiğinde pozitif basınç serbest bırakılır ve bu durum genellikle anında bir giga seal oluşumuyla sonuçlanır.Ancak, sızdırmazlığın sağlanamadığı bazı durumlarda, hafif bir negatif basınç uygulamak gerekir. Sızdırmazlık oluşumundan sonra, elektrot potansiyeli -80 milivolt'a ayarlanır ve negatif basınç uygulanması hücre membranını yırtar. Kap nöronu, 140 ile 180 mega ohm arasında bir giriş direnci ve +40 milivolt'u aşan bir aksiyon potansiyeli ile karakterize edilir.Bu durum, aksiyon potansiyeli tetiklenene kadar akım klembi altında kademeli olarak artan depolarizasyon basamakları enjekte edilerek test edilir. Ardından, mikroskop XY motorlu çevirici kullanılarak ventral kasa yönlendirilir. Yüksek büyütme altında, hedef alandan bir hızlı kas hücresi seçilir.Kas elektrodu, pozitif basınç altında hedef kas hücresine doğru ilerletilir ve basınç bırakıldığında bir giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturur; sodyum kanallarını inaktive etmek için elektrot potansiyeli -50 millivolt değerine ayarlanır. Ardından, hafif vakumlama ile hücre membranı yırtılır. Direncin 100 ila 200 mega ohm seviyesine düşmesi ve büyük kapasitif geçici sinyallerin aniden ortaya çıkması, test çiftine girişin gerçekleştiğini gösterir.Motor nöron kaydedilirken, bir aksiyon potansiyeli oluşana kadar kademeli olarak artırılan akım enjeksiyonları ile depolarize edilir. Bu noktada, kasla birlikte motor nöronun 1 Hz frekansta stimülasyonuna devam edildiğinde, başarısızlık olmaksızın bir uç plaka akımı oluşmalıdır. Stimülasyon frekansı 100 Hz'e çıkarıldığında, uç plaka akımlarının genliğinde dalgalanmalar meydana gelir ve 10 saniyelik stimülasyon içerisinde fonksiyonel tükenme gerçekleşir.Genellikle, nöron kaydı bir saate kadar kararlıdır, ancak kas hücreleri seri dirençteki artışla kendini gösteren bir bozulma sergiler. Bu durum gerçekleştiğinde, deney ya sonlandırılır ya da başka bir kas hücreye yama kenetleme uygulanır. Tüm kayıtlar bir saat içinde tamamlanmalıdır.Bir çift üzerinde uzmanlaşıldıktan sonra, kayıt işlemi bir ila bir buçuk saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca komşu segmentlerde bir veya iki ek çift elde etmek de mümkündür. Tipik bir kayıt günü, iki ila üç çift üretilmesini sağlar.Eşleşmiş motor nöron iskelet kası kayıtları, nöromüsküler iletimin temel işleyişini incelemek için benzersiz bir fırsat sunar. Motility mutant balık hatları ile birlikte kullanıldığında, nöromüsküler disfonksiyonun kaynağını belirleyebilir ve metastatik sendrom gibi insan hastalıklarının altında yatan mekanizmalara dair yeni bakış açıları sağlayabilir.

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, zebra balığı embriyolarında motor nöronların elektrofizyolojisini incelemek için invaziv olmayan bir testi göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının spontan depolarizasyonu sonucu embriyolarda kuyruk koilinin ölçümü yapıldıktan sonra, koilleme frekansını azaltmak için bir sodyum kanal blokeri uygulanır. Daha sonra, embriyolar agaroz içinde hareketsiz hale getirilir ve bir floresan mikroskobu altına yerleştirilir. Genetik olarak tasarlanmış motor nöronlar, bir donör ve bir alıcı...

Zebra Balığı Embriyolarında Motor Nöronların Elektrofizyolojisini İncelemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yaklaşım

Bu video, felçli bir zebra balığı larvasındaki afferent nöronlardan gelen elektrik sinyallerinin, lateral hat ganglionunun yakınına bir mikropipet yerleştirerek ve sinyal yakalama için gevşek bir conta oluşturarak kaydedilmesini göstermektedir. Hücre dışı çözelti, bu işlem sırasında nöronal canlılığı korur.

İmmobilize Bir Zebra Balığı Larvasında Afferent Nöronlardan Gelen Elektrik Sinyallerinin İzlenmesi

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi

Bu protokol, elektrofizyolojik çalışmalar için uygun, yetişkin, genç, larval ve embriyonik zebra balıklarından (Danio rerio) canlı kardiyak ve vasküler düz kas hücrelerinin akut izolasyonunu tanımlamaktadır.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin motor nöron ve hedef iskelet kasından eşzamanlı patch kelepçe kayıtları yapmayı Danio rerio larvalarında. Bu yöntem sinir-kas iletişimini ve sinaptik iletimi incelemek için kullanılır.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Daha fazla video keşfet