In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

Klatrin aracılı endositoz sırasında, klatrinin polihedral bir kafesi, SL one gibi klatrin bağlayıcı adaptör proteinler aracılığıyla membran proteinlerine veya lipidlere bağlanır; SL one, varyant klatrin kutusu veya VCB aracılığıyla klatrine bağlanır. Bu videoda, klatrin SLA one etkileşimlerinin analizi için üç yöntem kullanılmaktadır. İlk olarak, GFP etiketli doğal ve VCB mutant SLA one ifade eden maya hücreleri, döner disk konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

Ardından, mutasyonun endositoz kinetiği üzerindeki etkisini belirlemek için zaman ayarlı (time-lapse) videolar analiz edilir. İkinci olarak, klatrin kaynağı olarak yabani tip hücrelerden mayale sitozolik ekstraktları hazırlanır ve klatrin-VCB etkileşimini in vitro incelemek için G-S-T-V-C-B füzyon proteini çöktürme (pull down) analizleri gerçekleştirilir. Üçüncü olarak, natif ve VCB mutantlarını eksprese eden maya hücrelerinden toplam ekstraktlar hazırlanır.

In vivo ortamda SLA one klatrin bağlama afinitesi üzerindeki etkili mutasyonu incelemek için SLA one ve coun çöktürme işlemleri gerçekleştirilir. Sonuç olarak, elde edilen veriler VCB mutasyonunun endositozu geciktirdiğini ve SLA one'ın klatrine bağlanmasının kaybolduğunu göstermektedir. Bu mutantlarda, söz konusu yöntem endositozda klatrin adaptör dinamikleri hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem, sekresyon yolundaki veziküller içindeki diğer protein-protein etkileşimlerine de uygulanabilir. Genel olarak, endojen bir lokustan etiketli proteinlerin düşük ekspresyonu nedeniyle fotobeyazlamanın floresan sinyalini azaltabileceği için bu yöntemin zorluklar çıkaracağı bilinmektedir. Bu protokol, görüntü analizini fiziksel etkileşimlerin biyokimyasal çalışmalarıyla birleştirdiği için endositozu kontrol eden mekanizmaları incelemek adına oldukça güçlü bir yaklaşımdır. Endositoz sırasında klatrin adaptör etkileşimlerini incelemek için, klatrin adaptör proteini SLN1'in yerli ve mutant versiyonlarını GFP etiketiyle eksprese eden maya suşları oluşturulur. İlk olarak, homolog rekombinasyon yoluyla SLN1 C-terminusuna bir GFP etiketi eklenir.

Ardından, kromozomal lokustan mutant SL one ekspresyonu için fonksiyonel bir gen yeniden oluşturmak amacıyla, spesifik SL one yan dizilerini içeren RA three geni parçası kullanılarak seçici bir şekilde SLA one geni bozularak bir ara maya suşu oluşturulur. URA three, klatrin bağlanma motifi veya VCB içeren ve VCB içine nokta mutasyonların dahil edildiği bir SL one fragmanı ile değiştirilir. Elde edilen maya suşları daha sonra SLA one dinamiklerinin mikroskobik analizi için kullanılır.

Endositik bölgelerde, biyokimyasal deneyler için uygun olan TVY 6 1 14 gibi etiketsiz SLA one suşlarına VCB mutasyonu yerleştirmek için benzer bir yaklaşım kullanılır; işlem, SLA one GFP maya suşu ve SLA one A-A-A-G-F-P SLA one mutant suşunun, karanlıkta bir rotatör içinde, 30 °C'de, dört mililitre desteklenmiş SD besiyerinde büyütülmesiyle başlar. Mayalar 0,1 ila 0,4 OD 600 değerine ulaştığında, her kültürden bir mililitreyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca 4.000 ×g'de santrifüjleyin; santrifüjden sonra süpernatantın yaklaşık 950 µL'sini atın, hücreleri yaklaşık 50 µL olması gereken kalan sıvı içinde tekrar süspande edin. Hücre süspansiyonundan üç µL'yi bir mikroskopi lamı üzerine damlatın ve üzerini bir lam camı ile kapatın.

Örneği, odakla mikroskobundaki dönen disk üzerinde ışıktan koruyun. Lamı 100x yağ daldırma objektife yerleştirin. Parlak alan aydınlatmasını veya GFP'yi uyarmak ve tespit etmek için uygun filtrelerle birlikte 488 nanometre lazeri kullanarak doğru odak düzlemini belirleyin; hücrelerdeki SLA one GFP ve SLA one A-A-A-G-F-P için 500 milisaniyelik pozlama süresiyle, saniyede bir görüntü aralığıyla 150 saniye boyunca zaman serili görüntüler yakalayın.

GFP etiketli noktalar plazma membranının iç yüzeyinde belirecektir. Birkaç saniye boyunca kalıcı olacak ve sinyal hızla kaybolarak kılıf sökülmesini belirtecek şekilde hücrenin merkezine doğru hareket edecektir. Yazılımı kullanarak, lekelerin ortaya çıktığının görüldüğü vahşi tip SLA one GFP'ye ait bir time-lapse görüntüsünün bir bölümünü seçin.

Birkaç saniye boyunca kalır ve ardından kaybolur. Zaman atımlı görüntülerin her karesi için görüntünün bu bölümünü kırpın. Ardından, kareleri buradaki geçen zamana karşılık gelen bir eksen boyunca hizalayarak, 152. zaman atımlı görüntünün her karesindeki bu bölümü temsil eden bir chime grafiği oluşturmak için yazılımı kullanın; bu işlem Adobe Photoshop kullanılarak gösterilmiştir.

Her bir noktanın mevcut olduğu zaman atlamalı karelerin sayısını manuel olarak sayarak bekleme süresini hesaplayın. Bulguları bir hesap çizelgesine, chime grafiğine kaydedin. Her bir noktanın kaybolurken hücrenin iç kısmına doğru kıvrılması gerektiğini unutmayın.

Endositozu ve kılıfın çözülmesini yansıtın. Yaklaşık 40 hücre için hücre başına beş noktayı analiz edin. Ardından, GST protein afinite analizlerinde kullanmak üzere maya sitozolik ekstraktları elde etmek için bu işlemi SLA one A-A-A-G-F-P ile tekrarlayın.

Ekteki metindeki talimatlara uygun olarak, uygun maya suşunun üç litresini hazırlayarak başlayın. Peleti üç ila beş mililitre steril su içinde yeniden süspanse edin ve pelet tamamen süspanse olana kadar pipetle yukarı aşağı çekin. Ardından, 250 mililitrelik plastik bir behere yaklaşık 150 mililitre sıvı azot dökün. Şoklayın.

Mayayı, sıvı azotun içine dairesel bir hareketle damla damla ekleyerek dondurun. Topaklanmayı önlemek için peletlerin çözülmesine izin vermeyin ve gerekirse daha fazla sıvı azot ekleyin. Kabı soğutmak için paslanmaz çelik bir blender kabına sıvı azot dökün. Sıvı azotun neredeyse tamamen buharlaşmasını bekleyin.

Ardından dondurulmuş maya peletlerini ekleyin. Blenderı soğuk bir kauçuk tıpayla kapatın ve maya peletlerini 10 saniye boyunca öğütün. İçerikleri karıştırmak için üç dört kez ters çevirin ve öğütme adımını iki kez daha tekrarlayın.

Dondurulmuş maya, sıvı nitrojen içeren 50 mililitrelik konik tüplü bir soğutucu huni ile toz benzeri bir görünüme sahip olacaktır. Soğuk huni kullanarak, öğütülmüş mayayı tüpe aktarın. Dondurulmuş öğütülmüş maya, -80 °C'de saklanabilir veya hemen kullanılabilir.

Sitozolik ekstrakt elde etmek için, 15 mililitrelik konik bir tüp içerisinde üç gram donmuş öğütülmüş TV Y 6 1 4 mayasını tartın ve oda sıcaklığındaki, proteaz inhibitör kokteyli içeren Buffer a ile üç mililitrede yeniden süspanse edin. Tüpün kapağını kapatın ve içerik tamamen çözünene kadar birkaç kez altüst edin. Buz üzerine yerleştirin.

Ekstraktı 4 °C'de 20 dakika boyunca 300.000 G'de ultrasantrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı veyaletozolik ekstraktı bir pipet yardımıyla dikkatlice buz üzerindeki konik bir tüpe aktarın. 200 µL'lik bir pipet ucunun ucunu kesin ve bunu kullanarakletozolik ekstrakta, Tampon A içindeki %50'lik glutatyon küresel bulamacımdan 100 µL ekleyin. Örnek 15 dakika boyunca döndürülene kadar tüpü 4 °C'deki bir rotatöre yerleştirin.

Boncukları, 4 °C'de, 1000 G'de iki dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Sitozolik ekstrakt olan süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve girdi kontrol örneği için 50 µL ayırın. Bu aşamada dondurma işlemi önerilmez. Ekstraktı her zaman buz üzerinde tutun ve deneyle devam edin.

GST füzyon proteini afinite analizlerini gerçekleştirmek için, etiketli santrifüj tüplerine bir mililitre PBS, 50% glutatyon Sphero süspansiyonundan 30 µL Tampon A içinde ve 50 µg diyalize edilmiş G-S-T-G-S-T-V-C-B veya mutant G-S-T-V-C-B ekleyin. Bağlanmanın gerçekleşmesi için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün. Boncukları iki kez PBS ile ve bir kez Tampon A ile santrifüjleyerek yıkayın.

Her yıkamadan sonra 5,000 G'de 10 saniye santrifüj edin, ardından bir mililitre maya sitozolik ekstraktı ekleyin. Numune bir saat boyunca döndürüldükten sonra tüpü dört derece santigrat sıcaklıktaki bir rotatora yerleştirin. Boncukları dört derece santigrat sıcaklıkta 10 saniye boyunca 5,000 G'de santrifüj ederek çöktürün. Boncukları %0,1 Triton X 100 içeren Tampon A ile üç kez, ardından bir kez daha Tampon A ile yıkayın; her yıkamadan sonra dört derece santigrat sıcaklıkta 10 saniye santrifüj edin.

Son santrifüj işleminden sonra 5,000 G'de bekletin. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırmak için jel yükleme ucu kullanın. Bu aşamadan sonra numuneler -20 °C'de saklanabilir.

Daha sonra devam etmek için, her tüpe 15 mililitre iki kat lamb lee örnek tamponu ekleyin. Örnekleri bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 96 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, örneği tüpün dibine indirmek için örnekleri 5.000 G'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin.

Ko-presipitasyon deneyleri için toplam hücre ekstraktları elde etmek amacıyla, klatrin ağır zincirine karşı bir antikor kullanarak immünoblotlama ile örnekleri analiz edin. Donmuş öğütülmüş maya örneklerini, bu kez vahşi tip SL1 eksprese eden TVY614 suşu, TVY614 arka planında L-L-D-L-Q'dan A-A-A-L-Q'ya mutasyon taşıyan SL1 A-A-A suşu ve GPY3130 gibi SL1 geninin delesyonunu taşıyan bir SL1 delta suşu kullanarak daha önce olduğu gibi hazırlayın.

Konik tüplere iki gram dondurulmuş öğütülmüş maya ekleyin. Bunları, proteaz inhibitör kokteyli ve %2 triton X 100 içeren iki mililitre oda sıcaklığındaki tampon A içerisinde süspande edin; tüpün kapağını kapatın ve tamamen çözünene kadar birkaç kez ters yüz ederek karıştırın, ardından 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu sırada periyodik olarak ters yüz ederek karıştırmaya devam edin.

Materyali mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 ×g hızında santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı veya toplam hücre ekstraktını buz üzerindeki konik bir tüpe aktarın.

Bir pipet kullanarak, 4 °C'de 15 dakika boyunca döndürülmüş, tampon içerisindeki bir sfero bulamacından %50 protein konsantrasyonunda 100 µL ekleyin. Ardından, boncukları 4 °C'de 2 dakika boyunca 1000 G'de santrifüj ederek çöktürün ve S süpernatantını yeni bir tüpe aktarın. Ko-immünopresipitasyon analizlerini gerçekleştirmek için girdi kontrolü amacıyla 50 µL ekstrakt ayırın.

Etiketli mikrosantrifüj tüplerine bir mililitre PBS, 50% protein içeren bir tampon A'da sphero süspansiyonundan 30 µL ve iki µg tavşan anti sla. Bir antikor ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün. Boncukları iki kez PBS ile ve bir kez %1 tritton X 100 içeren tamponla yıkayın.

Toplam maya ekstraktlarından bir mililitre ekleyin. SLA one, SLA one A A A ve SLA one delta. 4 °C'de bir saat boyunca döndürün.

Boncukları çöktürmek için 5, 000 G'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve boncukları %0.1 Tritan X 101 içeren tampon A ile hızlıca üç kez yıkayın. Boncukları bir kez daha santrifüjle çöktürün ve bir jel yükleme ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırın.

Bu noktada, örnekler -20 °C'de saklanabilir. Daha sonraki bir zamanda devam etmek için her tüpe 15 µL 2x Laemmli örnek tamponu ekleyin. 96 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve 5.000 g'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Örnekleri, klatrin ağır zincirine karşı bir antikor kullanarak immün bloklama (immunoblotting) yöntemiyle analiz edin.

Yabani tip ve mutant SL1'den elde edilen canlı hücre görüntüleme sonuçları solda karşılaştırılmıştır. Hücre periferisinde yeşil renkle gösterilen SLA1 pozitif endositik bölgelere sahip tek bir maya hücresi görülmektedir. Beyaz çizgiler arasındaki alan, parlak alan görüntüsünde gösterilen kesitlerin oluşturulduğu bölgeye karşılık gelmektedir.

Mutantlardaki endositik bölgelerin, yabani tipte yaklaşık 30 saniye olmasına kıyasla, yaklaşık 80 saniye ile önemli ölçüde daha uzun süre kalıcı olduğu ve bunun kılıf oluşumunda bir defek olduğunu gösterdiği unutulmamalıdır. Klatrin ile sla bir varyant klatrin kutusu arasındaki fiziksel etkileşim, L-L-D-L-Q dizisini içeren AA 798'den 813'e kadar olan SLA bir fragmanına GST füzyonlanmış GST Füzyon Proteini Afinite analizleri ile değerlendirilmiştir.

Karşılık gelen A-A-A-L-Q mutantı veya tek başına GST, glutatyon sero boncuklarına bağlanmış ve vahşi tip maya hücrelerinden elde edilen sitozolik ekstrakt ile inkübe edilmiştir. İlişkili proteinler elüe edilmiş ve burada görüldüğü üzere klatrin ağır zinciri için immünoblotlama ile analiz edilmiştir. Klatrin, GST'ye veya G-S-T-V-C-B mutantına değil, G-S-T-V-C-B'ye bağlanmaktadır; bu durum, SLA1'in klatrine bağlanması için sağlam bir varyant klatrin kutusunun gerekli olduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, GS kültürlerinizin kontamine olmasını önlemek için her zaman alevin yakınında çalışmanız önemlidir. Farklı proteinlerin kolokalizasyonunu incelemek için RFP gibi diğer floresan proteinlerin etiketlenmesi işlemi de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyokimyasal ve floresan hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak protein-protein etkileşimlerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.