Name: In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Öğrenin, Sla1p adaptör proteininin klatrinle etkileşimini canlı hücre görüntüleme ve biyokimyasal yöntemlerle nasıl analiz edeceğinizi. Bu teknik endositoz kinetiğini incelemek için güçlü bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DF NSF Köprüler Doktora bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada kullanılan mikroskop Colorado State Üniversitesi Mikroskop Görüntüleme Ağ temel altyapı hibe tarafından kısmen desteklenmektedir. İş yazarı s laboratuvarda clathrin adaptörleri CSU start-up fonları ve SD Amerikan Kalp Derneği ödül 09SDG2280525 tarafından desteklenmektedir

1. SLA1 gen, GFP etiketi ve seçilebilir işaretleyici Incorporation Doğrudan bir GFP etiketi SLA1 gen açık okuma çerçevesi 3 'sonunda (Sla1p C-terminalindeki) sigorta ve gen E. ile eş zamanlı olarak işaretlemek için 17 Longtine yöntemi uygulayın G418 seçimini sağlar coli kan r gen. <ol><li> Ileri, bir şablon olarak plazmid pFA6a-GFP (S65T) kanMX6 18 ve aşağıdaki primerler kullanılarak PCR ile DNA parçası oluşturun: 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', ve tersine, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TTK TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. Altı çizili dizisi SLA1 gen belirli bir kesimi hemen önceki (ileri astar) ve stop kodon (ters astar) karşılık gelir. PCR ürünü agaroz jel elektroforezi DNA arıtma ayırın. </li><li> S. 50 ml kültür hazırlayın cerevisiae SEY6210 suşu (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901 lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) (19) YPD, erken logaritmik faz (OD 600 = 0,2-0,6) büyüyor. 2.000 xg'de 3 dakika oda sıcaklığında Spin, iki kez steril su ile yıkayın. </li><li> Lityum asetat prosedürü kullanarak 20 hücre içine 1. adımda elde edilen PCR parçası Transform. 1 ml YPD ve 30 az 4 saat süreyle inkübe ° C ile sallama eklemek hücreler, 1 ml steril su ile yıkayın. </li><li> YPD-G418, G418-dirençli transformants, 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe seçmek için plakalar üzerinde hücrelerinin yayılmasını. YPD-G418 plakaları koloniler ve çizgi onları seçin. </li><li> Kullanarak koloni-PCR, GFP-kan modülü düzgün homolog rekombinasyon SLA1 gen sekansları ile entegre edildiği transformants tanımlar. Ileri bir astar kullanın SLA1 açık okuma çerçevesi ve ters astar içinde tavlarıdır GFP-kan modülü içinde tavlarıdır. PCR ürünlerinin beklenen bir boyutu var ve sıralama ile doğrulamak koloniler belirleyin. </li><li> GFP floresan onaylamak için floresan mikroskobu ile koloniler Ekran. </li></ol> 2. Varyant clathrin kutusu (VCB) SLA1 geninde mutasyon <ol><li> Iki aşamalı bir yaklaşım 15 SLA1 geni (nükleotidler 2407-2415) AAALQ mutasyon LLDLQ tanıtın. </li><li> İlk olarak, SLA1 nükleotidler PCR ile 1207-1410 ve 2427-2589 yükseltmek ve sırasıyla pBluescriptKS Noti / BamHI ve EcoRI / Sali sitelerine parçaları klonu. </li><li> BamHI / EcoRI siteleri URA3 içeren bir PCR parçası haline Subclone. </li><li> Cleave Noti / Sali ile sonuçlanan plazmid, jel arıtma URA3 parçası izole ve Bölüm 1 ya da TVY614 (Mata ura3-52 leu2 3112 his3 Δ200 trp1 içine oluşturulan Sla1-GFP gerginlik içine lityum asetat dönüşümü ile tanıtmak Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4: LEU2 prb1: HISG prc1: HIS3) 21. </li><li> Urasil eksik tamamlanan SD plakalar üzerinde hücrelerinin yayılmasını. Koloni-PCR ile onaylayın ve sıralama Ura + koloniler VCB parçası yerine düzgün bir şekilde entegre URA3 içerir. </li><li> İkinci adımda ise, subclone SLA1 nükleotidler pBluescriptKS Noti / Sali sitelerine 1207-2589. QuickChange-XL siteye yönlendirilmiş mutasyon kiti (Stratagene), AAALQ VCB artıkları LLDLQ mutasyona. Sıralama tarafından olun. </li><li> Cleave BsgI / AgeI ile inşa ve mutant VCB parçasını içeren jel arıtma izole. Bölüm 2.3 'de elde edilen gerginlik içine pRS313 (HIS3) 22 BsgI / AgeI parçası Cotransform. </li><li> Histidin eksik tamamlanan SD plakalar üzerinde hücrelerinin yayılmasını. Mutant dizileri yenileyici, böylece AAALQ mutasyon (sla1 AAA) LLDLQ içeren sla1 gen URA3 yerine hücreleri tespit etmek 5-fluorotic asit içeren agar üzerine Replica plakalı Onun + koloniler. Koloni-PCR ve sıralama ile onaylayın. </li></ol> 3. Floresan mikroskopi <ol><li> Maya suşları bir OD 600 = 0.1-0.4 ulaşana kadar tamamlanan SD medya 4 ml 30 Bölüm 1 ve 2 ° C karanlık bir rotator Sla1-GFP ve sla1 AAA-GFP büyütün. Oda sıcaklığında 1 dakika için 4.000 xg'de mikrosantrifüj kültür 1ml Spin. Süpernatant ~ 950 ul atın. Kalan sıvı (~ 50 ul) hücreler tekrar </li><li> Mevduat 3 mikroskobu slayt üzerine hücre süspansiyonu ul ve cam lamel ile kaplayın. Örnek ışıktan koruyun. </li><li> Mount dönen bir disk konfokal mikroskop 100x yağ daldırma amacı kaydırın. </li><li> GFP ile floresan heyecanlandırmak ve tespit etmek için uygun filtreler ile aydınlık aydınlatma veya 488 nm lazer kullanarak hücrelerin doğru odak düzlemli bulun. </li><li> Maruz kalma süresi 500 ms (veya uygun değeri) hücrelerinde Sla1-GFP ve sla1 AAA-GFP zaman atlamalı görüntüler yakalayınn 150 saniye boyunca saniyede bir görüntü aralığı. Beklenen sonuç: sinyal hızla kaybolur olarak GFP etiketli punctae, hücre zarı sınırlayan iç yüzeyinde görünür birkaç saniye boyunca devam ve hücrenin merkezine doğru hareket (demontaj kat belirten). </li><li> Noktalar görünmesi, birkaç saniye kalır ve yok olan bir resmin bir bölümünü seçin. Zaman atlamalı görüntüleri her bir çerçeve için görüntü bu bölümünde kırpın. </li><li> Temsil eden bir görüntü bu bölümünde 150 saniyelik zaman atlamalı görüntü, her çerçeve içinde geçen zaman karşılık gelen bir eksen boyunca kare hizalayarak kymograph oluşturun. </li><li> (Time-lapse kare) noktalar kymograph kaç saniye dayanan her noktanın süresini hesaplayın. Not her yerinde ceket endositoz ve demontaj yansıtan yok gibi hücrenin içine doğru "eğrisi". </li><li> Vahşi tip Sla1-GFP sla1 AAA-GFP ile karşılaştırın. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için tekrarlayın. Beklenen sonuç: sla1 AAA-GFP noktalar (~ 80 sn) 15 kat oluşumu bir kusur gösteren vahşi tip (~ 30 sn) daha uzun süre önemli ölçüde devam etmektedir. </li></ol> 4. Maya sitozolik özü ve toplam hücre özü hazırlanması <ol><li> TVY614 21 gibi uygun bir maya suşu, YPD 3 litre İnokülasyon ve 30 büyümeye çalkalayıcı inkübatör ° C OD 600 = 1-2 ulaşana kadar. </li><li> 3.700 x g 20 dakika oda sıcaklığında maya kültürü santrifüjleyin. Süpernatantı atın, 3-5 ml steril su ekleyin ve pelet tamamen yeniden süspanse kadar pipet ve aşağı. </li><li> ~ 150 ml, 250 ml plastik beher, sıvı nitrojen dökün. Flash dondurma dondurulmuş pelet aglütinasyon önlemek için, dairesel bir kalıp içinde sıvı azot içine damla damla ekleyerek maya. Gerekirse daha fazla sıvı azot, pelet çözülme izin vermeyin. </li><li> Paslanmaz çelik blender kabı içinde sıvı azot dökerek soğutun. Sıvı azot neredeyse tamamen buharlaşması için izin verin. Soğuk blender kabı dondurulmuş maya pelet ekleyin. Blender kabı soğuk bir lastik tıpa ile kapatın ve 10 saniye boyunca maya pelet eziyet. Içeriğini karıştırın ve iki kez taşlama adımı tekrarlayın konteyner 3-4 kez ters çevirin. Zemin dondurulmuş maya, toz gibi bir görünüme sahip. </li><li> Sıvı nitrojen ile bir huni ve 50 ml konik tüp soğutun. Soğuk bir huni kullanarak, zemin maya tüp transferi. Donmuş toprak maya -80 ° C veya hemen kullanılmalıdır mağaza olabilir. </li><li> GST-füzyon protein yakınlık assay (Bölüm 5), ağırlığı 3 g donmuş zemin TVY614 maya 15 ml konik bir tüp içinde ve oda sıcaklığında tampon 3 ml tekrar süspansiyon için sitozolik özü elde etmek için A (10 mM HEPES, pH 7.0, proteaz inhibitörü kokteyli (Sigma) içeren 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Cap ve tüp tamamen çözülmüş ve ardından buz üzerine oturtacak kadar birkaç kez ters. </li><li> 4 özü ultrasantrifüjdeki ° C az 20 dakika süreyle 300.000 x g. Dikkatle pelet bozmadan bir pipet kullanarak konik bir tüp supernatant (sitozolik ekstresi) aktarın. Sitozolik özü buz üzerinde tutun. </li><li> Boncuklar pipeting kolaylaştırmak amacıyla, ucu sonu kesmek için uygun bir tampon A'da% 50 (v / v) glutatyon-sepharose bulamaç 100 ul ekleyin. 4 Döndür ° C 15 dakika, spin-aşağı 4 santrifüj boncuk ° C 2 dk, 1000 xg'de ve taze bir tüp supernatant (sitozolik ekstresi) aktarmak. Rezerv 50 ul giriş kontrolü için özü. </li><li> Co-immunoprecipitation deneyler için toplam hücre özleri (Part 6) elde etmek için, gerginlik TVY614 (WT SLA1), bir LLDLQ Bölüm 2, TVY614 arka planda oluşturulan AAALQ mutasyon taşıyan sla1 AAA gerginlik ve silme taşıyan bir sla1 gerginlik GPY3130 23 gibi SLA1 gen. Ağırlık 2 g konik tüpler ilgili donmuş zemin maya ve oda sıcaklığında tampon 2 ml onları tekrar süspansiyon, proteaz inhibitörü kokteyl (Sigma) ve% 2 Triton X-100 içeren. </li><li> Cap ve tüpü birkaç kez ters tamamen çözülmüş ve daha sonra periyodik olarak tersine çevirerek karıştırma, 10 dakika kadar buz üzerinde inkübe. </li><li> 4 mikrosantrifüj tüpleri ve spin malzeme transferi ° C 15 dakika 16.000 xg (mikrosantrifüj üst hız). Dikkatle pelet rahatsız olmadan bir pipet kullanarak buz üzerinde konik bir tüp supernatant (toplam hücre özü) transferi. </li><li> 4 Döndür tampon A'da% 50 (v / v) protein, A-sepharose bulamaç 100 ul ° aşağı spin-C, 15 dakika santrifüj yoluyla boncuk, 4 ° C ve 1000 xg'de 2 dk transferi supernatant (toplam ekstresi) taze bir tüp. Rezerv 50 ul giriş kontrolü için özü. </li></ol> 5. GST-füzyon proteini yakınlık tahlil <ol><li> PCR bir parçası containi tarafından Amplifyng Sla1p varyant clathrin-box (VCB) (artıkları 803-807), pGEX 5X-VCB elde etmek için pGEX-5X içine klonu. Sıralama tarafından olun. </li><li> PGEX-5X-VCB bir şablon olarak kullanma ve QuickChange-XL mutasyon kiti (Stratagene) site, pGEX 5X-vCBmut elde etmek için AAALQ VCB artıkları LLDLQ mutasyona. Sıralama tarafından olun. </li><li> Hızlı GST ve füzyon proteinleri ve GST-VCB ve E. GST-vCBmut coli (BL21 de3), glutatyon-sepharose, Zehir indirgenmiş glutatyon ile boncuklar kullanarak arındırmak, PBS karşı dialyze ve protein konsantrasyonu belirlemek. </li><li> Etiket 3 mikrosantrifüj borular: GST, GST-VCB ve GST-vCBmut ve 1 ml PBS, tampon% 50 (v / v) glutatyon-sepharose bulamaç 30 ul dialized GST, GST, ve 50 mikrogram eklemek VCB ya da GST-vCBmut füzyon proteinleri. </li><li> Bağlama için izin oda sıcaklığında 30 dakika çevirin. </li><li> Bölüm 4 açıklandığı gibi hazırlanmış - Her tüpe 1 ml, maya sitozolik özü tampon A. ile boncuk PBS ile 2 kez ve 1 kez yıkayın. </li><li> 5.000 pelet boncuk için xg tüpler 1 saat 4 ° C, spin 10 sn Döndür supernatant atmak ve hızlı bir şekilde tampon A. ile tampon boncuklar içeren% 0.1 Triton X-100 ve 1 kez 3 kere yıkayın </li><li> Bir kez daha ve bir jel yükleme ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı olarak kaldırmak boncuk aşağı spin. Bu noktada, daha sonraki bir zamanda devam örnekleri -20 ° C'de saklanabilir. </li><li> 96 ° C 'de 5 dakika inkübe her tüp, 2x Laemmli örnek tampon 15 ul ekleyin ve 5.000 x g. az 10 sn Spin </li><li> Clathrin ağır zincir antikor kullanarak immün örnekleri analiz edin. Beklenen sonuçlar: clathrin değil GST veya GST-vCBmut GST-VCB bağlanır. Ayrıca numunelerin GST füzyon proteinleri benzer yükleme onaylamak için SDS-PAGE ile analiz. </li></ol> 6. Co-immunoprecipitation tahlil <ol><li> Etiket 3 mikrosantrifüj borular: WT (yabani tip SLA1), sla1 AAA ve sla1Δ ve PBS 1 ml, 30 ul tampon A-sepharose bulamacı% 50 (v / v) protein, A, ve 2 mikrogram eklemek tavşan anti-Sla1p antikor. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika çevirin. </li><li> Boncuklar tampon A içeren% 1 Triton X-100 ve 1 kez PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> SLA1 sla1 AAA ve sla1Δ: Bölüm 4 hazırlanan karşılık gelen toplam maya özleri 1 ml ekleyin. 1 saat 4 ° C döndürmek </li><li> Spin 10 sn 5.000 pelet boncuk xg supernatant atmak ve hızlı bir şekilde boncuklar tamponu ile 3 kere yıkayın A içeren% 0.1 Triton X-100 ve 1 kez tampon A. </li><li> Bir kez daha ve bir jel yükleme ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı olarak kaldırmak boncuk aşağı spin. Bu noktada, daha sonraki bir zamanda devam örnekleri -20 ° C'de saklanabilir. </li><li> 96 ° C 'de 5 dakika inkübe her tüp, 2x Laemmli örnek tampon 15 ul ekleyin ve 5.000 x g. az 10 sn Spin </li><li> Clathrin ağır zincir antikor kullanarak immün örnekleri analiz edin. Beklenen sonuçlar: clathrin sla1 AAA veya sla1Δ örnek değil, vahşi tip Sla1p birlikte immunoprecipitates. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 canlı hücre floresan mikroskobu ile endositik siteler Sla1p clathrin adaptörü Analizi. Bir çerçeve (sol), Sla1-GFP veya bir LLDLQ AAALQ mutasyonu taşıyan sla1 AAA-GFP ifade maya hücreleri bir video ve buna karşılık gelen kymographs (sağda) . Yabani tip ve mutant Sla1-GFP endojen SLA1 lokus ifade edildi. Endositik siteler hücre çevre (sol görüntü) dağıtılan parlak noktalar olarak görülmektedir. Beyaz çizgiler arasındaki alanda, hangi kymographs oluşturulan bölgeye karşılık gelir. Filmler 1 kare / sn 'lik bir kare hızında alınmıştır. AAALQ mutant (sla1 AAA) LLDLQ vahşi tip (SLA1) ile karşılaştırıldığında daha uzun kullanım ömrü Sla1-GFP dikkat edin. <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 clathrin ve Sla1p varyant clathrin kutusu arasındaki fiziksel etkileşim. GST glutatyon-sepharose boncuklar bağlanır ve vahşi bir sitozolik ekstresi ile inkübe edildi dizisi LLDLQ (GST-VCB), ilgili AAALQ mutant (GST-vCBmut), ya da GST tek başına (GST) içeren parçası aa798-813 Sla1p erimiş tip maya hücreleri. Ilişkili proteinler clathrin ağır zincir (IB) immün yıkandı, ve analiz edildi.

<ol><li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+taken%3A+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li>
<li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+assembly+and+endocytosis%3A+from+yeast+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li>
<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Traub, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+for+sorting+of+transmembrane+proteins+to+endosomes+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes.</a> Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).</li>
<li>Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+clathrin-mediated+membrane+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding.</a> Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Clathrin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).</li>
<li>Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basket+weaving%3A+formation+and+function+of+clathrin-coated+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).</li>
<li>Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptors+for+clathrin+coats%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptors for clathrin coats: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+AP-3+adaptor+complex+with+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin.</a> Science. 280, 431-434 (1998).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-binding+proteins%3A+got+a+motif%3F+Join+the+network%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!</a> Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).</li>
<li>Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic-lethal+interactions+identify+two+novel+genes%2C+SLA1+and+SLA2%2C+that+control+membrane+cytoskeleton+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).</li>
<li>Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sla1p+serves+as+the+targeting+signal+recognition+factor+for+NPFX%281%2C2%29D-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis.</a> J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).</li>
<li>Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Sla1p+homology+domain+1+and+interaction+with+the+NPFxD+endocytic+internalization+motif%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif.</a> EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).</li>
<li>Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+clathrin+adaptor+function+in+endocytosis%3A+A+novel+role+for+the+SAM+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain.</a> EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123, 305-320 (2005).</li>
<li>Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-9561 (1998).</li>
<li>Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+HIS3+marker+and+GFP+reporter+modules+for+PCR-targeting+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 13, 1065-1075 (1997).</li>
<li>Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sorting+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+isolation+of+mutants+defective+in+the+delivery+and+processing+of+multiple+vacuolar+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases.</a> Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li>
<li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li>
</ol>

Clathrin kaplı vezikül (CCV) trans Golgi ağından endositoz ve ulaşım katılmak ve ökaryotik hücre biyolojisi için temel korunmuş yollar endosomes. Bu yöntem kağıt açıklanan yaklaşımlar, adaptör proteinler ve clathrin arasındaki etkileşimler, CCV oluşumu için sorumlu olan moleküler mekanizmalar çalışma yararlıdır. GST-füzyon proteini yakınlık ve ortak immunoprecipitation deneyleri bir adaptör (aday) ve clathrin arasındaki fiziksel ilişki test izin verir. GFP-etiketleme ve floresan mikroskobu görüntüleme canlı hüc...

<table border="1"><th> Malzeme </th><th> Şirket </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL site directed mutagenesis kiti </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo ve in vitro adaptör-clathrin etkileşim Çalışmaları

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Büyük bir endositik yolu taşıma kargo hücre yüzeyinden 1-6 endosomes clathrin kaplı vezikül (CCVs) oluşumunu başlatır. CCVs clathrin kat vezikül membran yüzlü bir kafes seçkin ve mekanik bir iskele olarak hizmet vermektedir. Clathrin kat bireysel clathrin triskelia, üç üç ağır ve hafif zincir alt birimden 7,8 oluşan clathrin çözünür formu vezikül oluşumu sırasında monte edilir. Triskelion doğrudan membran bağlama yeteneği olmadığından, clathrin bağlayıcı adaptörler, lipidler ve / veya membran proteinlerinin 9 dernek aracılığıyla membran oluşturan clathrin kafes bağlamak için kritik öneme sahiptir . Adaptörler ayrıca paket transmembran protein bu reseptörler olarak kargo, ve birbirleri ile ve diğer bileşenleri ile CCV, makine 9 etkileşimde bulunabilirsiniz. Clathrin adaptörler, yirminin üzerinde tanımlanmıştır birçok clathrin aracılı endositoz katılan ve diğerleri trans Golgi ağa lokalize veya 9 endosomes. HIP1R (maya Sla2p) hariç, tüm bilinen clathrin adaptörleri clathrin ağır zincir 9 N-terminal-pervane etki alanına bağlanır. Clathrin adaptörleri yapılandırılmamış esnek linkers bağlı katlanmış etki oluşan modüler proteinlerdir. Bu ilintileyiciniz bölgeler içinde, kısa bağlayıcı motifleri clathrin vezikül oluşumu makine 9 N-terminal etki alanı veya diğer bileşenler ile etkileşimleri arabuluculuk . İki ayrı clathrin bağlayıcı motifleri tarif edilmiştir: clathrin kutusu ve W-box 9. Konsensus clathrin kutu dizisi ilk olarak tanımlandı L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varyantları daha sonra 11 keşfedilen edilmiştir. W-box dizisi PWxxW (x herhangi bir kalıntı olduğu) için uygundur. Sla1p (Cehennem Aktin bağlayıcı protein-1 Sentetik), aslında bir aktin ilişkili protein olarak tanımlanan ve maya hücreleri 12 endositik sitelerinde normal aktin hücre iskeletinin yapısı ve dinamikleri için gerekli oldu . Sla1p NPFxD endositik sıralama sinyali bağlanır ve NPFxD sinyal 13,14 taşıyan kargo endositoz için kritik öneme sahiptir. Daha yakın zamanlarda, Sla1p clathrin kutusu, LLDLQ benzer bir motif ile clathrin bağlamak gösterildi, bir varyant clathrin-box (VCB) olarak adlandırılan ve 15 endositik clathrin bir adaptör olarak işlev. Buna ek olarak, Sla1p endositik canlı hücre floresan mikroskop çalışmaları 16 kat için yaygın olarak kullanılan bir belirteç haline gelmiştir. Burada adaptörü clathrin etkileşim çalışmaları için yaklaşımları tanımlamak için bir model olarak Sla1p kullanabilirsiniz. Biz canlı hücre floresan mikroskopi odaklanmak, aşağı GST-pull ve co-immunoprecipitation yöntemleri.

Clathrin-aracılı endositoz kargo seçimi ve clathrin kat montaj koordine adaptör proteinler bağlıdır. Burada bir model olarak maya endositik adaptör protein Sla1p kullanarak adaptörü clathrin fiziksel etkileşim ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

Önemli bir endositik yolak, kargoyu hücre yüzeyinden endozomlara taşıyan klatrin kaplı veziküllerin (CCV'ler) oluşumuyla başlar1-6. CCV'ler...

Klatrin aracılı endositoz sırasında, klatrinin çokyüzlü bir kafesi, SL one gibi klatrin bağlayıcı adaptör proteinler aracılığıyla membran proteinlerine veya lipidlere bağlanır; SL one, klatrine varyant klatrin kutusu veya VCB aracılığıyla bağlanır. Bu videoda, klatrin SLA one etkileşimlerinin analizi için üç yöntem kullanılmaktadır. İlk olarak, GFP etiketli doğal ve VCB mutant SLA one eksprese eden maya hücreleri, döner disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenir.Ardından, mutasyonun endositoz kinetiği üzerindeki etkisini belirlemek için time-lapse videolar analiz edilir. İkinci olarak, klatrin kaynağı olarak yabani tip hücrelerden maya sitozolik ekstraktları hazırlanır ve klatrin VCB etkileşimini in vitro incelemek için G-S-T-V-C-B füzyon proteini pull-down analizleri gerçekleştirilir. Üçüncü olarak, natif ve VCB mutantlarını eksprese eden maya hücrelerinden toplam ekstraktlar hazırlanır.SLA one ve coun çöktürmeleri, VCB mutasyonunun in vivo ortamda SLA one klatrin bağlanma afinitesi üzerindeki etkisini incelemek için gerçekleştirilir. Sonuç olarak, elde edilen veriler VCB mutasyonunun endositozu geciktirdiğini ve SLA one'ın klatrine bağlanmasının kaybolduğunu göstermektedi

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), epitelyal bir klor kanalı, çeşitli proteinler ile etkileşim ve önemli hücre süreçlerini düzenleyen bildirilmiştir; aralarında CFTR PDZ motifi aracılı etkileşimleri de belgelenmiştir. Bu protokol bizim karmaşık bir sinyal PDZ bağımlı CFTR makromoleküler birleştirmek için geliştirilen yöntemler...

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Yetkili transmembran reseptörleri sinyal romanın tanımlanması için yüksek içerik tarama yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem büyük ölçekli otomasyon mükellef olup tanır hakkında...

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Öğrenin, Sla1p adaptör proteininin klatrinle etkileşimini canlı hücre görüntüleme ve biyokimyasal yöntemlerle nasıl analiz edeceğinizi. Bu teknik endositoz kinetiğini incelemek için güçlü bir yaklaşım sunar.

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

Daha fazla video keşfet