Name: Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Öğrenin Anopheles sivrisinek hücrelerinde kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler kullanarak hedef gen mutagenezisi yöntemini. Bu teknik, sitometri ile gen dönüşüm frekanslarını belirleyerek vektör biyolojisi araştırmalarında genetik manipülasyon için uygulanabilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sitometrisi ile ona yardım için California Ulusal primat Araştırma Merkezi Abbie Spinner teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) AI073745, AI080799 ve AI078183 fon tarafından desteklenmiştir.

<ol><li> Protokol başlamadan önce, bu deneyde kullanılan sivrisinek hücreleri sağlıklı ve ~% 80 birleştiği noktada yer yapışık eğer (Şekil 1) olduğunu belirlemek önemlidir. Büyümüş ya da sağlıksız hücreleri düşük transfeksiyon verimlilik ve tutarsız sonuçlar verecektir. </li><li> 30 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda kullanmak için önce tüm medya Isınma. <ol class="lalpha"><li> MEM, Earle w / glutamin,% 5 ısı inaktive FCS,% 0.2 D-glukoz,% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik ve% 1 non-esansiyel amino asitleri: A. stephensi MSQ43 hücreleri E5 orta gerektirir . </li><li> A. gambiae SUA5B hücreleri S2 ortama ihtiyaç Schneider Drosophila, orta,% 5 ısı inaktive FCS, ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik : </li></ol></li><li> Tüm transfeksiyon reaktif malzemeler, plazmid ve oligonükleotidler çözülme ve buz üzerinde saklayın. </li><li> Tüm işlemler, steril tekniği kullanarak bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır. </li><li> Yapışık hücrelere (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) hücreleri bozmadan eski medya aspire için, 28 kaynaştı taze medya eşdeğer bir hacim ekleme ° C ve daha sonra alt hücreleri durulayın bir pipet kullanarak şişesi. </li><li> Hücre konsantrasyonu belirlenir ve 1x10 6 hücre / mL son konsantrasyon için ayarlanabilir olmalıdır. Transfeksiyon reaktif malzemeleri hazırlarken Hücreler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li><li> 6 plaka her iyi sivrisinek hücreleri (1x10 6 hücre / ml) 1 ml ekleyin. Her deneysel koşul için (aşağıya bakın) bir tabak ayarlayın. Tablo I, genel bir transfeksiyon için pipetleme şeması. Tablo II BFP özel LNA-ons kullanarak tek bir nükleotid başarılı mutagenez test etmek için beş temel şartından özetliyor. Ilk iki pGFP ve pBFP, sırasıyla pozitif ve negatif kontroller. Kalan BFP özel LNA-ons artan konsantrasyonları ile pBFPs deneysel koşullar. 8 - 12 üzerinden adımları buna göre, her durum için uygun miktarda reaktif ekleyin. </li><li> 1,5 mL steril bir mikrosantrifüj tüp plazmid DNA transferi ve AT tampon uygun hacim ekleme. <ol class="lalpha"><li> 1 mcL plazmid DNA (1 mcg / ml), 99 EC tampon mcL ekleyin. </li><li> 1 mcL pGFP (mcL / 1μg) için, 99 EC tampon mcL ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) için, 99 EC tampon mcL ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) ve 1 mcL ON (mcg / ml), 98 EC tampon mcL ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) ve ON 5 mcL (mcL / 1μg) için, 94 EC tampon mcL ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) ve ON 10 mcL (mcL / 1μg) için, 89 EC tampon mcL ekleyin. </li></ol></li><li> Sonra yavaş yavaş 1 mcg başına kullanılan DNA Enhancer ekleyin. <ol class="lalpha"><li> 1 mcL plazmid DNA için, 8 mcL Enhancer ekleyin. </li><li> 1 mcL pGFP için, 8 mcL Enhancer ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP için, 8 mcL Enhancer ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 1 mcL için, 16 mcL Enhancer ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 5 mcL için, 48 mcL Enhancer ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 10 mcL için, 88 mcL Enhancer ekleyin. </li></ol></li><li> 1 sn ve çözüm tüpün alt kısmında emin olun Vortex DNA / tampon / Enhancer karışımı. Sonra 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 10 saniye boyunca 1 mg plazmid DNA ve vorteks başına Effectene reaktif ekleyin. Çözüm 10 dakika oda sıcaklığında inkübe sonra tüpün dibinde olduğunu ve onaylayın. <ol class="lalpha"><li> 1 mcL plazmid DNA için 10 mcL Effectene (Tablo I) ekleyebilirsiniz. </li><li> 1 mcL pGFP için, 10 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP için, 10 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 1 mcL için, 20 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 5 mcL için, 60 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 10 mcL için, 110 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin. </li></ol></li><li> Isıtılmış medya DNA / tampon / Enhancer / Effectene karışıma damla damla eklenerek son hacim 1000 mcL her tüp getirin. Medya çok çabuk eklenir DNA olabilir, bu noktada hızlandırabilir. 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme hafifçe karıştırın. <ol class="lalpha"><li> 1 mcL plazmid DNA için, 882 mcL medya (Tablo I) ekleyebilirsiniz. </li><li> 1 mcL pGFP için, 882 mcL medya (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 mcL pBFP için, 882 mcL medya (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 1 mcL için, 864 mcL medya (Tablo II) ekleyin. </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 5 mcL için, 792 mcL medya (Tablo II). </li><li> 1 ON mcL pBFP ve 10 mcL için, 702 mcL medya (Tablo II) ekleyin. </li></ol></li><li> Sonra yavaş yavaş her bir seferde bir damla 1 ml uygun DNA / Enhancer / Effectene karışımı ekleyin. </li><li> Swirl plaka nazikçe hücreleri ve transfeksiyon karışımı eşit dağılımını sağlamak için. Incubathücrelerin normal büyüme koşulları altında e. </li><li> Bir gün Transfeksiyonu sonra, yavaşça medya dışarı aspirat ve yavaş yavaş taze ısındı ortam eşdeğer bir hacmi ile değiştirin. Bunu yaparken kuyuların dibinde hücre tabakalarından rahatsız değil önemlidir. </li><li> İki gün sonra transfeksiyon transfeksiyon verimlilik (Şekil 2) belirlemek için floresan mikroskop altında pGFP transfekte pozitif kontrol hücreleri inceler. </li><li> SUA5B hücreler çok hızlı büyür ve büyümüş olacak. Dört gün sonra eski ortam aspire ve taze ısındı ortam yavaş yavaş eşdeğer bir hacim ekleme transfeksiyon ince bu hücrelerin. </li><li> Kuyuları için yeni medya ekledikten sonra, her bir kuyunun dibinden yukarı pipeting tüm hücreleri ayırmak ve aşağı, hücre karışımından yarım hacmi (1 ml) atın ve 2 için son hacmi getirmek için 1 ml taze ısındı medya eklemek ml. </li><li> Gerektiği gibi ince, sağlıklı ve büyümüş değil emin olun günlük hücreleri kontrol edin. </li><li> Hücrelerin analiz için bunları toplamak için normal şartlar altında 5-7 gün transfeksiyon önce büyümek için izin verin. </li><li> 5-7 gün transfeksiyon, tüm kuyularda eski medya aspire ve her bir kuyu için 1 mL steril oda sıcaklığında PBS ekleyerek hücreleri toplamak. </li><li> Kuyunun dibinden yukarı ve aşağı pipetleme tarafından hücreleri ayırın ve hücre karışımı 5 ml ani kap tüpleri transferi ve hemen hücreler flow sitometri ile analiz. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Untransfected sağlıklı A. stephensi MSQ43 (A) ve A. yaklaşık% 80 izdiham gambiae SUA5B (B) hücreleri. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 A. stephensi MSQ43 (A) ve A. gambiae SUA5B (B) hücrelerin pozitif kontrol GFP ile plazmid ifade transfekte. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Flow sitometri BFP-özel kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler (LNA-ons) ile tek nükleotid aşağıdaki transfeksiyon mutagenez BFP dönüşüm yoluyla GFP doğrulayan veriler. SUA5B hücreler, negatif kontrol olarak (pBFP) plazmid ifade eden bir BFP ile, pozitif kontrol olarak plazmid ifade GFP (pGFP) ile transfekte, ya da pBFP ve BFP özel LNA-ons artan konsantrasyonlarda. (A), soldan sağa doğru gösteren akış sitometri veri Ayırıcı stratejisi:, canlı hücreleri, propidium iyodür (PI) negatif hücreler ve transfeksiyon aşağıdaki GFP pozitif hücrelerin beş gün ileri karşı tarafında dağılım. (B) (A) LNA-ons pBFP ve artan konsantrasyonlarda aşağıdaki transfeksiyon GFP pozitif hücrelerin yüzdesi Grafik gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo I. Transfeksiyon. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tablo 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 2"> Tablo II. Şekil 1'de kullanılan Transfeksiyon.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Burada A. LNA-ons transfeksiyon aşağıdaki episomal bir gen hedef tek bir nükleotid hedeflenen dönüşüm için in vitro metod ve kanıtların bir mevcut stephensi ve A. gambiae hücreleri. LNA-ON-aracılı gen dönüşümü bir site-spesifik DNA onarım yanıt indüksiyon gerektirir; bizim veri sivrisinek hücreleri için bu siteye özgü mutagenez mekanizması destek olduğunu göstermektedir. Burada sunulan yöntem episomal bir hedef dönüşüm dayalı iken, bizim veri, diğer sistemlerde olduğu gibi LNA-ON-arac...

<table><tbody><tr><td>Effectene transfeksiyon reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>GFP kontrol plazmidi (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>BFP plazmidi (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Dr. Concordet'ten hediye&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ON'lar</td><td></td><td></td><td>Dr. Concordet'ten hediye&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, glutaminli Earle&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>%10 D-glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin antibiyotiği</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu kültür plakaları</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler transfeksiyon ve sivrisinek hücreler hedef genler mutagenez

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Sıtma parazitinin, sıtma etkeni, her yıl 250 milyon yeni enfeksiyon sonucu enfekte Anofel sivrisinek sokması ile bulaşır. Onlarca yıllık araştırma rağmen, sıtmaya karşı bir aşı roman kontrol stratejileri için gereğinin altını, hala orada. Bir yenilikçi bir yaklaşım etkili sıtma paraziti iletimini kontrol etmek için genetiği değiştirilmiş sivrisineklerin kullanılmasıdır. Parazit geliştirme 1 düzenlemek için kasıtlı olarak değişiklikler, hedef mutagenez üzerinden sivrisinek hücre sinyal yolları bulundu. Bu çalışmalarda, biz, dönüşüm için potansiyel gen hedefler belirlemeye başlayabilirsiniz. Hedeflenen mutagenez, geleneksel bir hedef gen ve büyük bir DNA molekülü arasındaki homolog rekombinasyon güvenerek vardır. Ancak, stabil bir şekilde dönüştürülmüş hücre hatları üretimi için bu tür karmaşık DNA molekülleri inşası ve kullanımı, pahalı, zaman alıcı ve genellikle verimsiz. Bu nedenle, kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler (LNA-ons) kullanarak bir strateji episomal ve kromozomal DNA gen hedefleri (2) içine yapay tek nükleotid değiştirmelerin tanıtmak için yararlı bir alternatif sağlar. LNA-ON-aracılı hedef mutagenez, maya ve fareler 3,4 hem de kültür hücreleri ilgi genler nokta mutasyonları tanıtmak için kullanılır olmuştur . LNA-ons Anofel gambiae ve Anofel stephensi hücreleri hem de yeşil floresan protein (GFP) ifade mavi floresan protein (BFP) ifadesi bir anahtarı sonuçları transfekte episomal hedef tek bir nükleotid değişimi tanıtmak için kullanılabileceğini gösteriyor . Bu dönüşüm, sivrisinek hücreleri hedef genlerin etkili mutagenez LNA-ons aracılık ve bu tekniği, in vitro ve in vivo kromozomal hedefleri mutagenez için geçerli olabileceğini düşündürmektedir ki ilk kez gösteriyor.

Hem de özel transfekte hedef genlerin tek bir nükleotid yerine Oligonükleotidler sitesi için kullanılabilir<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Ve<em&gt; Anofel stephensi</em&gt; Hücreler.

Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez

Sıtarmı neden olan Plasmodium parazitleri, enfekte Anopheles sivrisineklerinin ısırmaları yoluyla bulaşmakta ve yılda 250 milyondan fazla yeni...

Bu prosedürün genel amacı, anofeles sivrisinek hücrelerinde bölgeye özgü mutajenez için yeni bir strateji göstermektir. Bu işlem, öncelikle transfeksiyon için sağlıklı kültürlenmiş hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından hücreler, transfeksiyon reaktiflerinin eklenmesi yoluyla uygun kontrol ve test DNA'ları ile transfekte edilir.Prosedürün bir sonraki adımı, kontrol hücrelerini floresan açısından izlemek ve deneysel hücrelerin yoğunluğunu azaltmaktır. Son olarak, transfeksiyondan beş ila yedi gün sonra, akış sitometrisi kullanılarak deneysel hücrelerdeki gen dönüşüm frekansları belirlenebilir. Nihayetinde, kilitli nükleik asit oligonükleotid kaynaklı DNA onarımı yoluyla, episomal bir gen hedefinin bölgeye özgü mutajenezini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben California Üniversitesi Davis'teki Tıbbi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Shirley Lockhart'ın laboratuvarından Dr. Nazy Pacor. Bugün size, anomalies sivrisinek hücrelerinde bölgeye özgü mutageneze yönelik yeni bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, bölgeye özgü mutagenez yoluyla sivrisinek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı genlerinin işlevini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Protokole başlamadan önce, sağlıklı ve yaklaşık %80 konfluense ulaşmış sivrisinek hücreleri temin edin. Eğer hücreler yapışkansa, aşırı büyümüş veya sağlıksız hücreler düşük transfeksiyon verimliliğine yol açacak ve tutarsız sonuçlar verecektir.Bu protokol ananais Gambier SUA beş B hücreleri ile gösterilmiştir. Bununla birlikte, Ananais ensi MS Q4 üç hücreleri de kullanılabilir. Transfeksiyon kurulumuna, S iki medyasını 28 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca ısıtarak başlayın.Tüm transfeksiyon reaktifi materyalleri, plazmid ve oligonükleotidleri buz üzerinde tutun. Doku kültürü kabininde steril teknik kullanarak, hücreleri rahatsız etmeden eski medyumu aspire edin; ardından hücreleri flasks tabanından durulamak için eş hacimde ısıtılmış taze medyum ekleyin. Bir pipet kullanarak hücre konsantrasyonu belirlenmeli ve mililitre başına 1 × 10⁶ hücre olacak şekilde nihai konsantrasyona ayarlanmalıdır.Final konsantrasyon ayarlandıktan sonra, altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa bir mililitre sivrisinek hücresi ekleyin. Transfeksiyon reaktifi materyalleri hazırlanırken hücreler oda sıcaklığında tutulabilir; bu sırada transfer plazmid DNA'sını steril mikro santrifüj tüplerine aktarın. Burada, pozitif kontrol olarak yeşil floresan protein eksprese eden plazmid ve negatif kontrol olarak mavi floresan protein eksprese eden plazmid kullanılmıştır.Test DNA'sı ayrıca BFP eksprese eden plazmidi içerir, ancak artan konsantrasyonlarda BFP'ye özgü kilitli nükleik asit, modifiye oligonükleotitler veya LNA os'lar eklenmiştir. DNA alikotlara ayrıldıktan sonra, her bir mikrogram plazmid DNA'sı ve L-N-A-O-N için 99 mikrolitre kage ve EC tamponu ekleyin. Ardından, kullanılan her bir mikrogram DNA başına sekiz mikrolitre enhancer'ı yavaşça ekleyin ve DNA tamponu-enhancer karışımını vorteksleyin.Çözeltiyi bir saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin ve örnekleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Mikrogram başına 10 µL etkileyici reaktif ekleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. Çözeltiyi tüplerin dibine çöktürmek için kısa süreliğine santrifüjleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, DNA tampon geliştirici etkileşim karışımına yavaşça taze ısıtılmış medya ekleyerek her tüpün final hacmini 1000 µL'ye tamamlayın. Medya çok hızlı eklenirse bu aşamada DNA çökelebilir; bu nedenle pipetle üç veya dört kez aşağı yukarı yaparak nazikçe karıştırın.Son olarak, her bir hücre kuyucuğuna uygun DNA güçlendirici etkili karışımdan bir mililitre yavaşça ekleyin. Her seferinde bir damla şeklinde ekleme yapın. Hücrelerin ve transeksiyon karışımının homojen dağılımını sağlamak için plakayı nazikçe çalkalayın.Transfeksiyondan bir gün sonra hücreleri normal büyüme koşullarında inkübe edin, medyumun hücrelerin üzerinden nazikçe aspire edin ve yavaşça eş hacimde taze ısıtılmış medyumla değiştirin. Kuyucukların altındaki hücre tabakalarını rahatsız etmemeye özen gösterin. Transfeksiyondan iki gün sonra, transfeksiyon verimliliğini belirlemek için GFP ekspres eden plazmit ile transfekte edilmiş pozitif kontrol hücrelerini floresan mikroskop altında inceleyin.Transfeksiyondan dört gün sonra, B hücreleri çok hızlı büyüdükleri ve aşırı çoğaldıkları için seyreltilmeleri gerekir. Bunu yapmak için, eski medyumu hücrelerin üzerinden aspire edin ve yavaşça eş hacimde taze ısıtılmış medyum ekleyin. Kuyucuklara yeni medyum ekledikten sonra, pipetle yukarı aşağı çekerek tüm hücreleri her kuyucuğun tabanından ayırın, hücre karışımının hacminin yarısını atın ve final hacmi iki mililitreye tamamlamak için bir mililitre taze ısıtılmış medyum ekleyin.Hücrelerin sağlıklı olduğundan ve aşırı çoğalmadığından emin olmak için onları günlük olarak kontrol edin. Gerektiğinde hücreleri seyreltin. Analiz için toplamadan önce, hücrelerin transfeksiyondan sonra beş ila yedi gün boyunca normal koşullar altında büyümesine izin verin.Transfeksiyondan beş ila yedi gün sonra, hücrelerin üzerindeki eski medyumu aspire ederek ve her birine bir mililitre steril oda sıcaklığında PBS ekleyerek hücreleri toplayın. Pipetle yukarı ve aşağı çekerek hücreleri her bir kuyucuğun tabanından ayırın. Son olarak, hücre karışımını beş mililitrelik snap kapaklı tüplere aktarın ve hücreleri derhal akış sitometrisi ile analiz edin.Savunma gözü. MS Q4 üç ve bir gambier UA beş B hücreleri, pozitif kontrol GFP eksprese eden plazmid ile transfekte edildi. Hücreler ışık ve floresan mikroskobunda gösterilmiştir ve birleşik görüntü akış sitometrisi verileri, BFP spesifik LNAO Ns'lerle transfeksiyonu takiben tek bir nükleotidin mutajenezi yoluyla BFP'den GFP'ye dönüşümü doğrulamaktadır. SUA beş B hücreleri; pozitif kontrol olarak GFP eksprese eden plazmid ile, negatif kontrol olarak BFP eksprese eden plazmid ile veya BFP eksprese eden plazmid ve artan konsantrasyonlarda BFP spesifik LNAO ns'lerle transfekte edildi.Akış sitometrisi verileri için kullanılan kapılama stratejisi; canlı hücrelerin, propidyum iyodür negatif hücrelerin ve transfeksiyondan beş gün sonra GFP pozitif hücrelerin ileri saçılma (forward scatter) ve yan saçılma (side scatter) değerlerini göstermektedir. BFP eksprese eden plazmid ve artan konsantrasyonlarda LNAO NS ile yapılan transfeksiyondan sonra GFP pozitif hücrelerin yüzdesi burada grafik formunda görülebilir ve bu durum L aos tarafından BFP'nin GFP'ye dönüştürüldüğünü doğrulamaktadır. Size, Aedes mosquito hücrelerinde anomalilerin site-yönelimli mutajenezi için yeni bir prosedür göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, transfeksiyon öncesinde hücrelerinizin sağlıklı ve doğru yoğunlukta olduğundan emin olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir.İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

transfection-mutagenesis-target-genes-mosquito-cells-locked-nucleic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

bipartit GAL4-UAS sistemi, Anopheles gambiae'de fonksiyonel genetik analize izin veren kontrollü bir mekansal şekilde gen ekspresyonunun değiştirilmesi için çok yönlü bir araçtır. Bu sistemi kullanmak için açıklanan prosedürler yarı standart bir klonlama stratejisi, floresan protein belirteçleri ve embriyo fiksasyonu için pupaların cinsiyetlenmesi ve taranmasıdır.

Anopheles gambiae'de Fonksiyonel Genetik için GAL4-UAS Sistemini Kullanma

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Burada bildirilen protokoller, laboratuvar içeren küçük kafes denemelerinde vektör kontrolüne yönelik genetik olarak tasarlanmış sivrisineklerin performansını değerlendirmenin üç alternatif yolunu göstermektedir. Her protokol, sivrisinek suşunun taşıdığı (gen tahriki veya gen dışı tahrik) ve ölçülen parametre türlerine özel modifikasyona göre uyarlanmıştır.

Genetik Olarak Tasarlanmış Anopheline Sivrisineklerinin Küçük Kafes Laboratuvar Denemeleri

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Öğrenin Anopheles sivrisinek hücrelerinde kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler kullanarak hedef gen mutagenezisi yöntemini. Bu teknik, sitometri ile gen dönüşüm frekanslarını belirleyerek vektör biyolojisi araştırmalarında genetik manipülasyon için uygulanabilir bir yaklaşım sunar.

Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez

Daha fazla video keşfet