Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize
December 10th, 2010
Bir faj gösterim kütüphanesi hedef kemiği de peptit dizileri tanımlamak için kullanılır oldu. Amacı, mezenkimal hücre farklılaşması, bu peptitler etkisini araştırmak ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için.
Bu deneyin genel amacı, mezenkimal hücre farklılaşmasını güçlendiren ve kemik onarımını destekleyen dizileri tanımlamaktır. İlk adım, kemiğe bağlanan fajı biop kaydırma ile izole etmektir. Mezenkimal hücrelere bağlanan peptit dizilerini tanımlamaya devam edin ve ayrıca gen ekspresyonundaki sonraki değişiklikleri belirleyin.
Peptit dizilerinin rejeneratif amaçlar için kemiğe nasıl verilebileceğini belirlemek için deneyler yapın. Son adım olarak, histolojik olarak birlikte ele alınan kemik onarımını incelemek, sonuçların in vitro hücre farklılaşması ve in vivo kemik onarımı mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sunabileceğini unutmayın. Biop kaydırma tekniğini bir faj görüntüleme kütüphanesi ile kullanmanın avantajları, kemiği hedef alan peptitleri tanımlayabilmemiz ve mezenkimal hücrelerin farklılaşmasını uyarmak ve kemik onarımını güçlendirmek için kullanılabilmemizdir.
Sonuç olarak, bu peptit dizileri, kemik onarımı için terapötik modalitelerde ve osteopeni ve osteoporoz gibi kemik kaybının tedavisinde yararlı olabilir. ULA ve Pascal'ın biyop kaydırmanın kan damarlarını hedef alan peptit dizilerini izole etmek için kullanılabileceğini gösterdiği bir çalışmaya dayanarak, bu yöntemi kemikteki mekanizmaları sorgulamak için uyarlamayı seçtik. İn vivo biyop kaydırma prosedürü için, 10 haftalık bir kapak C faresinin kalbinden N-E-B-P-H-D 12 faj ekran peptit kütüphanesinin 10. plak gerçekleştiren birimlerine 10 kez 10 kez perfüze edilir.
Yaklaşık beş dakika sonra, fareyi ötenazi yapın, femurları açığa çıkarın ve inceleyin, uçlarını kesin ve kemik iliğini çıkarın. Sol uyluk kemiğini PBS ile hem içeride hem de dışarıda 10 kez durulayın. Sonra kemiği ER 2 5 3 7 bakterilerine ekleyin.
Bağlanmamış fajı çıkarmak için, sağ uyluk kemiğinin ara kanalını 10 kez durulamak için 21 gauge iğneli bir şırıngada %2 kurutulmuş yağsız süt kullanın. Şimdi bağlı fajı ara kanaldan hidroklorik asit glisin tamponu ile boşaltın. pH 2.2 bir mo la triss ile nötralize edilmiştir.
Fajı çoğaltmak için, EIT'yi ER 2 5 3 7 bakterisine ekleyin ve 4.5 saat boyunca kültürleyin. Süpernatanları dikkatlice taze tüplere aktarın ve polietilen glikol ilavesiyle fajı üç kez çökeltin. Sodyum klorür çözeltisi, tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Son olarak, peleti TBS'de %0.02 Sodyum azid ile yeniden süspanse edin. Amplifiye edilmiş EIT'lerin plak oluşturan birimlerini belirlemek için fajı plakalar üzerine plak haline getirin. Hem kaçan hem de ayrılmayan faj için in vivo biyo kaydırma prosedürünü dört kez tekrarlayın.
Bakteri kültürlerinde havuzlanmış fajı çoğaltın. Faj görüntüleme kiti ile birlikte verilen 98 primer kullanarak son faj DNA'sı olan DNA dizisini saflaştırın ve nicelleştirin. Daha da önemlisi, faj DNA dizisi temsilinin sıklığını hesaplayın.
Şimdi bir glisin, glisin, glisin, sinüs, lizin dizisi, tohum içeren peptitleri sentezleyin ve D bir hücreyi çoğaltın. Laboratuvarımızda %90 birleşme hızında geliştirilen klonlanmış bir fare çok potansiyelli kemik iliği stromal hücre hattı. Tripsin, jelatin kaplı hazne kuyusu slaytları ve 24 saat boyunca kültür üzerindeki peptit boyama plakası hücreleri için pelet ve sayım için hücreler ve santrifüjdür.
Hücreleri PBS ile yıkayın ve 30 dakika boyunca% 4 paraldehit ile sabitleyin. Şimdi glisin ile bloke edici inkübasyonları gerçekleştirin, ardından BSA Aden ve BBSA takip edin. Biyotin bloke edici çözeltiler.
100 mikromolar biyotinile edilmiş L yedi ve R bir peptit ekleyin. Hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkamaya devam edin. Bir ila 1000 seyreltme LOR strippin kapağı ve folyo ekleyin ve karanlık bir çekmecede 30 dakika inkübe edin.
Hücreleri yıkayın ve kapak fişlerini vektör kalkanı Montaj ortamı ile monte edin. Şimdi slaytları ameliyattan 24 saat önce floresan mikroskop altında analiz edin. Jel köpük silindirlerini ıslatın.
Jel köpük silindirlerini 20 mikromolar peptit, L yedi veya R bir veya peptitsiz PBS tamponu ile steril 12'ye aktarın. Bulaşıkları iyi bir şekilde kültürleyin ve ameliyat sırasında gece boyunca dört santigrat derecede soğutun. Jel telefon kompozitini kullanana kadar buzun üzerine yerleştirin.
Tuzlu sulama altında pnömatik bir çapak kullanarak, üç milimetre genişliğinde ve sekiz milimetre uzunluğunda büyük bir dikdörtgen uni kortikal kusur oluşturun. Kemik defektini hazırlanmış jel köpüklerle, implante edilmiş tüm iskeleleri hafif bir dokunuş kullanarak yerleştirerek tedavi edin. Sıçanları ötenazi yapın ve tibiayı belirli zaman noktalarında toplayın, kemik defektini dikkatlice kontrol edin ve hasat edilen tibiayı parafin kesiti için% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
Son olarak, osteo matrisini etiketlemek için tüm doku bölümlerini hematin eozin ile boyayın. Aden etiketli floresein izotiyosiyanat, in vitro olarak yetiştirilen hücreler üzerindeki peptitlerin bağlanmasının mikroskobik olarak tespit edilmesine izin verir. Burada peptitler, peptitlerin hücreler üzerindeki osteojenik etkisini belirlemek için kültürdeki mezenkimal hücrelere bağlanır.
Kültürdeki in vitro mezenkimal hücreler, hücre morfolojisindeki değişiklikleri belirlemek için test peptitleri ile tedavi edilebilir. Örneğin, dördüncü günde, hücreler toplanmaya başlar ve agregalar zamanla nodüller oluşturmak için genişler. İlginç bir şekilde, kemik bölümü UV ışığı altında h ve e otofloresan ile boyanmıştır.
Kemik ve kemik olmayan dokular arasındaki bu daha büyük kontrast, jel köpük artı peptit ile tedavi edilen defektlerde kemik onarımını belirlemek için bölümlerdeki kemik varlığını ölçen analizleri kolaylaştırır. Burada tek başına jel köpüğü ile karşılaştırıldığında, artı peptit ile doldurulmuş kusurlar, bu prosedürü denerken zamanla en fazla kortikal onarım gösterdi. Son peptit grubunu seçene kadar zaman içinde her zaman birikecek olan çok sayıda örnek nedeniyle veri girişinizde son derece metodik olmak önemlidir.
Kemiği hedef alan peptitleri tanımlamak için bir teknik olarak in vivo biop panning'in geliştirilmesi, artık kemik onarımı ve kemik kaybı için bir tedavi olarak kullanılabilecek potansiyel ilaçlara sahip olduğumuz anlamına gelir. Kemik onarımının altında yatan mekanizmalardan biri de kemik kaybında rol oynar. Bu mekanizmaları daha ayrıntılı olarak anlamak ve gecikmiş kırıklar ve osteoporoz gibi bozuklukların tedavisinde kullanılabilecek araçlara sahip olmak, sağlık hizmetleri için geliştirilebilecek tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
Genel Bakış
Bu çalışma, kemiği hedef alan peptit dizilerini ve bunların mezenkimal hücre farklılaşması ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkilerini araştırmaktadır. Fag görüntüleme kütüphanesi kullanılarak, araştırma kemik onarım mekanizmalarını artırabilecek peptitleri tanımlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kemik rejenerasyonu
- Mezenkimal hücre farklılaşması
- Fag görüntüleme teknolojisi
Arka Plan
- Kemik onarımı, osteopeni ve osteoporoz gibi durumların tedavisi için kritik öneme sahiptir.
- Kemiği hedef alan peptitleri tanımlamak yeni tedavi stratejileri geliştirebilir.
- Biopanning, spesifik peptit dizilerini izole etmek için kullanılan bir tekniktir.
- Hücre farklılaşması mekanizmalarının anlaşılması, rejeneratif tıbbı geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Mezenkimal hücre farklılaşmasını teşvik eden peptit dizilerini tanımlamak.
- Bu peptitlerin kemik onarımını artırmadaki potansiyellerini değerlendirmek.
- Bu peptitlerin kemik dokusuna teslim yöntemlerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kemiği bağlayan fajı izole etmek için in vivo biopanning.
- Tanımlanan peptitlerle tedavi edilen mezenkimal hücrelerin gen ekspresyon analizi.
- Tedavi edilen defektlerde kemik onarımının histolojik incelenmesi.
- Peptit bağlanmasının kültürdeki hücrelere mikroskopik analizi.
Ana Sonuçlar
- Mezenkimal hücrelere etkili bir şekilde bağlanan peptitler tanımlandı.
- Peptit yüklü scaffoldlarla tedavi edilen defektlerde kemik onarımının arttığı gösterildi.
- Osteojenik farklılaşmayı gösteren hücre morfolojisinde değişiklikler gözlendi.
- Histolojik analiz, peptit tedavisi ile korteks onarımının arttığını doğruladı.
Sonuçlar
- Çalışma, peptit aracılı kemik onarım mekanizmaları hakkında bilgiler sağlamaktadır.
- Tanımlanan peptitler, kemik kaybı durumları için potansiyel tedavi uygulamalarına sahiptir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu peptitlerin kemik rejenerasyonundaki rolünü daha da açıklığa kavuşturabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This study demonstrates how phage display-derived peptides can modulate mesenchymal cell differentiation to enhance bone repair, offering a target validation strategy for regenerative therapeutics. The approach supports early discovery by identifying bioactive sequences that potentiate osteogenesis in preclinical models. Such target-de-risking tools improve predictive confidence in bone anabolic pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies peptides that bind bone and modulate mesenchymal cell gene expression, supporting target hypothesis interrogation.
- Operational Value: Enables functional validation of osteogenic targets through alkaline phosphatase activity and nodule formation assays.
- Predictive Value: Increases confidence in lead selection by linking peptide binding to Runx2, Osterix, BSP, and Osteocalcin upregulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible in vitro system to screen peptides for osteogenic potential using mesenchymal cell differentiation readouts.
- Operational Value: Standardizes assay conditions via collagen sponge delivery and histological quantification of cortical repair.
- Scalability Value: Supports phage display library screening for peptide candidates with defined binding and functional outputs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity from in vitro mesenchymal differentiation to in vivo unicortical defect repair.
- Operational Value: Uses collagen matrix delivery to enable standardized preclinical testing of peptide therapeutics.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by linking peptide treatment to both gene expression changes and histological bone formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation in bone repair models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of peptide-mediated mesenchymal cell differentiation and pathway clarification via Runx2/Osterix axis.
- Screening: Enables assay-ready systems for evaluating peptide effects on alkaline phosphatase and mineralization nodules.
- Analytics: Generates quantitative gene expression and histological readouts to compare osteogenic potential across peptide candidates.
- Translational Research: Connects in vitro osteogenic markers to in vivo bone defect repair, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes phage display as a reusable platform for identifying tissue-targeting peptides across regenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by linking peptide binding to functional osteogenic outcomes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible readouts for mesenchymal differentiation and bone repair across models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking osteoinductive mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of peptide candidates based on in vitro and in vivo efficacy data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, peptide synthesis, and mesenchymal cell culture.
- Needs infrastructure for in vivo biopanning, histological staining, and fluorescent microscopy.
- Demands standardization of peptide dosing, collagen scaffold preparation, and defect model surgery.
- Involves adaptation considerations when translating peptide activity across different mesenchymal cell sources or defect models.
- Limited by the need for empirical validation of peptide stability and bioavailability in delivery matrices.
