Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Bu deneyin genel amacı, mezenkimal hücre farklılaşmasını potansiyalize eden ve kemik onarımını teşvik eden dizileri belirlemektir. İlk adım, biyop tarama (biop panning) yöntemiyle kemiğe bağlanan faji izole etmektir. Ardından, mezenkimal hücrelere bağlanan peptit dizileri belirlenmeli ve buna bağlı olarak gen ekspresyonunda meydana gelen sonraki değişiklikler saptanmalıdır.

Peptit dizilerinin rejeneratif amaçlarla kemiğe nasıl iletilebileceğini belirlemek için deneyler gerçekleştirin. Son bir adım olarak, kemik onarımını histolojik olarak inceleyin; sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, in vitro hücre farklılaşması ve in vivo kemik onarımı mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sunabilir. Bir fago teşhir kütüphanesi ile biopanning tekniği kullanmanın avantajları, kemiği hedefleyen ve mezenkimal hücrelerin farklılaşmasını stimüle etmek ve kemik onarımını potansiyelize etmek için kullanılabilecek peptitleri tanımlayabilmiş olmamızdır.

Nihayetinde, bu peptid dizileri kemik onarımına yönelik terapötik modalitelerde ve osteopeni ile osteoporoz gibi kemik kaybı durumlarının tedavisinde faydalı olabilir. ULA ve Pascal'ın biop panning yönteminin kan damarlarını hedefleyen peptid dizilerini izole etmek için kullanılabileceğini gösterdiği bir çalışmaya dayanarak, biz de bu yöntemi kemikteki mekanizmaları sorgulamak için uyarlamayı tercih ettik. In vivo biop panning prosedürü için, 10¹⁰ plak oluşturan birimindeki N-E-B-P-H-D 12 faji sergileme peptid kütüphanesi, 10 haftalık bir valve C faresinin kalbi aracılığıyla perfüze edildi.

Yaklaşık beş dakika sonra fareyi ötanize edin, femur kemiklerini açığa çıkarıp disseke edin, uçlarını kesin ve kemik iliğini uzaklaştırın. Sol femuru hem içten hem dıştan 10 kez PBS ile durulayın. Ardından kemiği ER 2 5 3 7 bakterilerinin bulunduğu ortama ekleyin.

Bağlanmamış fajları uzaklaştırmak için, 21 gauge iğneli bir şırınga ile %2'lik kurutulmuş yağsız süt kullanarak sağ femur ara kanalını 10 kez durulayın. Ardından, bağlanmış fajları bir molar tris ile nötralize edilmiş pH 2.2 hidroklorik asit glisin tamponu ile ara kanaldan elüye edin.

Fajı çoğaltmak için, ER 2 5 3 7 bakterilerine EIT ekleyin ve 4,5 saat boyunca kültüre edin. Süpernatanları dikkatlice yeni tüplere aktarın ve polietilen glikol sodyum klorür çözeltisi ekleyerek fajı üç kez çöktürün; tüpleri dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.

Son olarak, peleti %0,02 sodyum azid içeren TBS içerisinde yeniden süspande edin. Amplifiye edilen EIT'lerin plak oluşturan birimlerini belirlemek için fajları plakalara ekin. İn vivo biyopanning prosedürünü hem elüye edilen hem de elüye edilmeyen fajlar için dört kez tekrarlayın.

Havuzlanmış fajları bakteri kültürlerinde çoğaltın. Faj display kiti ile birlikte sağlanan 98 primerini kullanarak, nihai faj DNA'sı olan DNA dizisini saflaştırın ve miktarını belirleyin. Önemli bir nokta olarak, faj DNA dizisi temsilinin frekansını hesaplayın.

Şimdi glisin glisin glisin serin lizin sekansı içeren peptitleri sentezleyin ve laboratuvarımızda geliştirilen klonlanmış bir fare multipotansiyel kemik iliği stromal hücre hattı olan D1 hücrelerini %90 konfluense kadar çoğaltın. Hücreleri tripsinizle ayırın, pelletlemek için santrifüjleyin ve peptit boyaması için sayın; hücreleri jelatin kaplı chamber slide lamlara ekip 24 saat boyunca kültüre edin.

Hücreleri PBS ile yıkayın ve 30 dakika boyunca %4 paraldehit ile sabitleyin. Ardından glisinle başlayarak, ardından BSA Aden ve BBSA biotin bloklama çözeltileri ile bloklama inkübasyonlarını gerçekleştirin.

100 µM biyotinize L seven ve R one peptitleri ekleyin. Hücreleri PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işleminden geçirin. 1/1000 dilüsyonunda LOR strippin ekleyin, üzerini folyo ile kapatın ve karanlık bir çekmecede 30 dakika inkübe edin.

Hücreleri yıkayın ve lamelleri vector shield montaj medyumu ile kapatın. Şimdi, cerrahi işlemden 24 saat önce lamları floresan mikroskobu altında analiz edin. Jel sünger silindirlerini ıslatın.

20 µM L7 veya R1 peptid içeren veya peptid içermeyen PBS tamponlu jel köpük silindirleri steril 12 kuyucuklu kültür kaplarına aktarın ve cerrahi işlem saatine kadar gece boyunca 4 °C'de soğutun. Jel köpük kompozitini kullanana kadar buz üzerinde bekletin.

Salin irrigasyonu altında pnömatik bir frez kullanarak, üç milimetre genişliğinde ve sekiz milimetre uzunluğunda, geniş, oblong, unikortikal bir defekt oluşturun. Hazırlanan jel köpükleri, tüm implant edilen iskeleleri hafifçe vurarak yerleştirerek kemik defektine uygulayın. Sıçanları ötanize edin ve belirlenen zaman noktalarında tibyaları toplayın; kemik defektini dikkatlice kontrol edin ve hasat edilen tibyaları parafin kesitleme için %10 nötr tamponlu formalinde sabitleyin.

Son olarak, kemik matriksini işaretlemek için tüm doku kesitlerini hematoksilin-eosin ile boyayın. Fluorescein isothiocyanate ile işaretlenmiş Aden, in vitro büyütülen hücrelerdeki peptid bağlanmasının mikroskobik olarak tespit edilmesine olanak tanır. Burada, peptidlerin hücreler üzerindeki osteojenik etkisini belirlemek için peptidler kültürdeki mezenkimal hücrelere bağlanır.

Kültürdeki in vitro mezenkimal hücreler, hücre morfolojisindeki değişiklikleri belirlemek için test peptitleri ile işlenebilir. Örneğin, dördüncü günde hücreler agrege olmaya başlar ve agregatlar zamanla büyüyerek nodülleri oluşturur. İlginç bir şekilde, h ve e ile boyanmış kemik kesiti UV ışığı altında otofloresans gösterir.

Kemik ve kemik dışı dokular arasındaki bu daha yüksek kontrast, gelfoam artı peptid ile tedavi edilen defektlerdeki kemik onarımını belirlemek için kesitlerdeki kemik varlığını nicelendiren analizleri kolaylaştırır. Yalnızca gelfoam ile karşılaştırıldığında, burada artı peptid ile doldurulan defektler zamanla en yüksek miktarda kortikal onarım göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, nihai peptid grubunu seçene kadar zamanla kaçınılmaz olarak birikecek olan çok sayıda örnek nedeniyle veri girişinde son derece metodik olmak önemlidir.

Kemik hedefli peptidleri tanımlamak için bir teknik olarak in vivo biop panning geliştirilmesi, artık kemik onarımı ve kemik kaybı tedavisi için kullanılabilecek potansiyel ilaçlara sahip olduğumuz anlamına gelmektedir. Kemik onarımının temelini oluşturan mekanizmalardan biri, aynı zamanda kemik kaybında da rol oynamaktadır. Bu mekanizmaların daha ayrıntılı olarak anlaşılması ve gecikmiş kırıklar ile osteoporoz gibi bozuklukların tedavisi için kullanılabilecek araçların geliştirilmesi, sağlık hizmetleri için tasarlanabilecek tedavilerin iyileştirilmesine yardımcı olacaktır.