Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alfa virüsleri, duyarlı sivrisinek hücrelerini minimal sitopatoloji ile kalıcı olarak enfekte eden, sivrisinekler tarafından taşınan RNA virüsleridir. Bu protokol, vektör enfeksiyonunun ve virüs transmisyonunun tespiti için floresan raporlayıcılar eksprese eden enfeksiyöz alfa virüs transduksiyon sistemlerinin faydasını göstermektedir. İlk olarak, dişi sivrisineklere ilgili alfa virüsünü içeren bir kan öğünü verin, ardından sivrisinek enfeksiyon verimliliğini belirleyin ve yalnızca marker geni eksprese eden sivrisinekleri seçin.

Ardından, enfekte sivrisineklerden tükürük toplayın ve toplanan tükürükle kültürlenmiş sivrisinek hücrelerini enfekte ederek bulaşıcılığı kanıtlayın. Sonuçlar epi-floresan mikroskopi ile elde edilir. GFP benzeri bir protein raporunu görselleştirin ve böylece vektör enfeksiyonunu ve virüs iletimini sivrisineklerin sekizli veya QE türleri üzerinden takip edin.

Alfa virüs ekspresyon sistemleri veya ATS'ler, hem arbovirüs çalışmaları için hem de sivrisinek transgenezi gibi daha zorlu sivrisinek manipülasyonlarını gerçekleştirmeden önce, gen ekspresyonunu ve vektör sivrisinekleri hızlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilir. Bu prosedürleri, Dr. Ken Olson'ın laboratuvarından Dr. Irma Sanchez Vargas, Dr. Eric Mossel ve Aaron Phillips gösterecektir. Bhk 21 hücrelerinde bir TS virüsü üretmek için, in vitro transkripsiyonu takiben GFP raporlayıcısını eksprese eden bir symbis rekombinant virüs kullanın ve genomik alfa virüs transduksiyon sistemi RNA'sını bhk 21 hücrelerine elektropore edin.

Ardından, enfeksiyondan önce virüsü kurtarın ve çoğaltın. Sivrisineklerin yapay bir besleyiciden etkili bir şekilde kan beslemesi yapabilmeleri için gıda yoksunluğu ile hazırlayın. Beslemeden 24 saat önce şekeri ve 12 saat önce suyu kesin.

Sivrisineklerin orta bağırsağının verimli bir şekilde enfekte edilmesi için, ticari olarak temin edilen defibrille veya sitratlı hayvan kanını, hazırlanan hücre kültürü kaynaklı TS virüs süspansiyonu ile karıştırın. Sivrisineklerin kan emmesini teşvik etmek amacıyla, kan öğünü için mililitre başına 10⁷ plak oluşturan birim virüs titresi hazırlayın. Final konsantrasyonu 0,02 molar olacak şekilde TP ekleyin.

Gözenekli bir bağırsak membranını su ceketli cam besleyicinin ağzına yerleştirin. Ardından, besleyicileri 37 °C sirkülasyonlu su ile kurun. Daha sonra besin maddesini pipetle hazneye aktarın ve besleyicileri karton üzerine güvenli bir şekilde yerleştirin.

Sivrisinekleri 10 ila 30 dakika boyunca besledikten sonra, seçilen sivrisineklerde TS virüsünün replikasyonu ve yayılımına izin vermek amacıyla, kanla doygun örnekleri belirlemek için soğuk anestezi uygulanan sivrisinekleri ayıklayın. Bunları 28 °C ve %75 bağıl nemde sekiz ila 10 gün boyunca inkübe edin. Sivrisinekleri immobilize etmek için.

Kağıt tutucu kartonu yaklaşık 15 dakika boyunca 4 °C'de bekletin. Ardından, 5 ila 10 sivrisineği, floresan mikroskobunda kullanıma uygun bir soğutma tablasına aktarın. Sivrisinekleri floresan varlığına veya yokluğuna göre inceleyin ve ayıklayın.

Seçilen sivrisinekleri, istendiği şekilde kullanmak üzere kağıt kartona geri koyun. Bu noktada, floresan yoğunluğunu bir gösterge olarak kullanarak enfeksiyon verimliliğini belirleyin. Son olarak, orta bağırsaklar, SIV bezleri ve yağ cisimcikleri gibi dokuları diseke edin ve floresan varlığını izleyin.

İstenirse bu organ ve dokular daha erken zamanlarda diseke edilebilir. Besleme öncesinde sivrisineklerin şeker kaynağına erişimini 24 saat boyunca kesin. Isıtılmış, çekilmiş ve kesilmiş 50 µL'lik bir kapiler tüpü üç ila beş µL Cargill ile hazırlayın.

Sivrisineklerin kaçmasını önlemek için B tipi daldırma yağı ekleyin. Bacaklarını ve kanatlarını çıkarın. Şimdi probosisi tüpün içine yerleştirin.

Probostan immersiyon yağına sızan tükürük damlacıklarını dikkatle izleyin. Gerekiyorsa, tükürük salgısını artırmak için sivrisinek toraksına %1 pilokarpin damlatın; 60 ila 90 dakika sonra sivrisinekleri çıkarın ve gelecekteki virüs izolasyonları için saklayın. Kapiller tüpten çözeltiyi toplamak için, tükürük-yağ karışımını 500 µL steril %20 F-B-S-P-B-S içeren bir tüpe boşaltın.

İnokulumu 0,2 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve ardından bu inokulumu kültürlenmiş sivrisinek hücrelerini enfekte etmek için kullanın. Beş primer DS MRE 16 GFP virüsü ile enfeksiyonun etkinliği, GFP ekspresyonu ile değerlendirilir. Zamanla bu hücreler, 0,01 enfeksiyon çokluğu ile virüsle enfekte edilmiştir.

Bir epi-floresan mikroskop, enfeksiyondan 10 gün sonra enfekte sivrisineğin tüm vücudundaki GFP görünümünün yanı sıra vücudun farklı bölümlerindeki görünümüne de olanak tanır. GFP'nin organ seçici ekspresyonu, yaygın bir enfeksiyonun göstergesidir. Orta bağırsaklarda, virüs içeren bir kan öğününün alınmasından kısa bir süre sonra genellikle belirgin enfeksiyon odakları bulunur ve bu odaklar enfeksiyon sonrası ilerleyen zamanlarda arka orta bağırsağa yayılır.

Bu olaylar GFP ve DS RED raporlayıcıları ile işaretlenir. Transmisyon deneyi, five prime DS MRE 16 GFP virüsünün ekstrinsik inkübasyon süresi boyunca stabil bir şekilde GFP eksprese ettiğini göstermektedir. Buradaki sivrisineklerde GFP ve sivrisinek tükürüğü, enfeksiyondan sonraki sekizinci gün kadar erken bir dönemde tespit edilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir A TS virüsünün bir sivrisineğe oral yolla nasıl bulaştırılacağı, sivrisinekteki virüs enfeksiyonunun görsel olarak nasıl değerlendirileceği ve virüsün sivrisinekten bulaşımının nasıl belirleneceği konularında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.