Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alfa virüsleri, minimal sitopatoloji ile duyarlı sivrisinek hücrelerini kalıcı olarak enfekte eden sivrisinek doğumlu RNA virüsleridir. Bu protokol, vektör enfeksiyonu ve virüs bulaşmasının tespiti için floresan raportörleri eksprese eden bulaşıcı alfa virüsü dönüştürücü sistemlerin faydasını gösterir. Önce dişi sivrisineklere ilgilenilen alfa virüsünü içeren bir kan unu verin, ardından sivrisinek enfeksiyonu verimliliğini belirleyin ve sadece belirteç genini ifade eden sivrisinekleri seçin.

Daha sonra, enfekte sivrisineklerden tükürük toplayın ve kültürlenmiş sivrisinek hücrelerini toplanan tükürük ile enfekte ederek bulaşıcılığı gösterin. Epi floresan mikroskobu ile elde edilen sonuçlar. GFP gibi bir protein raporunu görselleştirin ve böylece seksenler veya QE sivrisinek türleri tarafından vektör enfeksiyonu ve virüs bulaşmasını izleyin.

Alfa virüs ekspresyon sistemleri veya ATS'ler, hem arbovirüs çalışmaları için hem de sivrisinek transgenezi gibi daha zor sivrisinek manipülasyonları yapmadan önce gen ekspresyonunu ve vektör sivrisineklerini hızlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilir. Bu prosedürleri gösterenler Dr.Ken Olson'un laboratuvarından Dr.Irma Sanchez Vargas, Dr.Eric Mossel ve Aaron Phillips olacak. Bhk 21 hücrelerinde bir TS virüsü üretmek için, in vitro transkripsiyonu takiben GFP raportörünü eksprese eden bir symbis rekombinant virüs kullanın, genomik alfa virüsü transdüksiyon sistemi RNA'sını bhk 21 hücrelerine elektro oranlayın.

Daha sonra enfeksiyondan önce virüsü kurtarın ve güçlendirin. Besin yoksunluğu ile yapay bir besleyiciden verimli kan beslemesi için birinci sınıf sivrisinekler. Yemden 24 saat önce şekeri ve 12 saat önce suyu alın.

Ticari olarak elde edilen defibrillenmiş veya sitratlı hayvan kanı, hazırlanan hücre kültürü ile karıştırılmış, sivrisineklerin etkili orta bağırsak enfeksiyonu için bir TS virüsü Süspansiyonu türetilmiştir. Sivrisinekleri şişmeye teşvik etmek için kan unu için mililitre virüs titresi başına yedi plak oluşturan birime 10 ila 10 formüle edin. 0.02 molar final konsantrasyonuna bir TP ekleyin.

Su ceketli cam besleyicinin ağzının üzerine bir gözenek işareti bağırsak zarı yerleştirin. Ardından, besleyicileri 37 santigrat derece su ile dolaşan ayarlayın. Ardından yemeği hazneye pipetleyin ve besleyicileri kartonun üzerine güvenli bir şekilde yerleştirin.

Sivrisinekleri 10 ila 30 dakika boyunca besledikten sonra, seçilen sivrisineklerde bir TS virüsünün replikasyonuna ve yayılmasına izin vermek için kanla tıkanmış örnekler için soğuk anestezik sivrisinekleri sıralayın. Onları sekiz ila 10 gün boyunca 28 santigrat derece ve% 75 bağıl nemde inkübe edin. Sivrisinekleri hareketsiz hale getirmek için.

Kağıt tutma kartonunu yaklaşık 15 dakika boyunca dört santigrat derecede yerleştirin. Şimdi, beş ila 10 sivrisineği floresan mikroskobunda kullanılmak üzere uyarlanmış bir soğutma masasına aktarın. Sivrisinekleri floresan varlığına veya yokluğuna göre inceleyin ve sıralayın.

Seçilen sivrisinekleri istediğiniz gibi kullanmak üzere kağıt kartona geri koyun. Bu noktada, floresan yoğunluğunu vekil olarak kullanarak enfeksiyon verimliliğini belirleyin. Son olarak, orta bağırsaklar, SIV bezleri ve yağ kütleleri gibi dokuları inceleyin ve floresan için izleyin.

İstenirse bu organ ve dokular daha erken zamanlarda diseke edilebilir. Yemden 24 saat önce sivrisinekleri şeker kaynağından mahrum edin. Üç ila beş mikrolitre Cargill ile ısıtılmış, çekilmiş ve kesilmiş 50 mikrolitrelik bir kılcal boru hazırlayın.

Sivrisineklerin kaçmamasını sağlamak için B tipi daldırma yağı. Bacaklarını ve kanatlarını çıkarın. Şimdi proboları tüpe yerleştirin.

Probolardan daldırma yağına sızan tükürük damlacıklarını dikkatlice izleyin. Gerekirse, 60 ila 90 dakika sonra tükürük salgısını artırmak için sivrisinek göğsüne %1'lik bir damla pilokarpin koyun, sivrisinekleri çıkarın ve gelecekteki virüs izolasyonu için saklayın. Şimdi kılcal borudan çözelti elde etmek için, tükürük yağı karışımını 500 mikrolitre% 20 F-B-S-P-B-S steril içeren bir tüpe atın.

İnokulumu 0.2 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve daha sonra bu inokulumu sivrisinek hücrelerindeki kültürlenmiş hücreleri enfekte etmek için kullanın. Beş prime DS MRE 16 GFP virüsü ile enfeksiyonun etkinliği, GFP ekspresyonu ile değerlendirilir. Zamanla, bu hücreler 0.01 enfeksiyon çokluğunda virüs ile enfekte oldu.

Bir epi floresan mikroskobu, enfekte sivrisinekte ve enfeksiyondan 10 gün sonra burada farklı vücut bölgelerinde GFP'nin tüm vücut görüntüsüne izin verir. GFP'nin organ seçici ekspresyonu, yaygın bir enfeksiyonun göstergesidir. Orta bağırsaklar genellikle, enfeksiyondan sonraki zamanlarda arka orta bağırsağa yayılan virüs içeren bir kan unu yedikten sonra erken dönemde belirgin odak enfeksiyonuna sahiptir.

Bu olaylara GFP ve DS RED muhabirleri tarafından işaret ediliyor. İletim testi, beş asal DS MRE 16 GFP virüsünün, dışsal inkübasyon süresi boyunca GFP'yi kararlı bir şekilde eksprese ettiğini göstermektedir. Buradaki sivrisinekte, GFP ve sivrisinek tükürüğü enfeksiyondan sekiz gün sonra tespit edilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir A TS virüsünün bir sivrisineğe oral yoldan nasıl bulaştırılacağını, bir sivrisinekte virüs enfeksiyonunun görsel olarak nasıl değerlendirileceğini ve sivrisinekten virüs bulaşmasının nasıl değerlendirileceğini iyi anlamalısınız.