Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant döl elde etmek için kemirgen sıtma paraziti plasmodium yoi'nin genetik çaprazlamasını gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle bir grup fareye, çaprazlanacak parazitlerin iki ebeveyn klonunu içeren karma bir inokulum enjekte edilerek sağlanır. Enfekte fareler daha sonra sivrisinekleri beslemek için kullanılır; burada her bir ebeveyn suşun gametleri birleşerek diploid bir zigot oluşturur. Bu aşamadaki mayotik bölünme genetik rekombinasyona yol açarak rekombinant döl üretilmesini sağlar.

Elde edilen sporozoitler daha sonra sivrisineklerin tükürük bezlerinden toplanır ve sınırlı dilüsyon ile izole edilebilen bireysel rekombinant klonları içeren kan evresi parazitlerini elde etmek amacıyla naif alıcı farelere yeniden enjekte edilir. Başarılı bir deneyde, klonlanan hatların %5 ila 10'u rekombinant olacaktır ve bunlar uygun genetik markörler için genotipleme yapılarak karakterize edilebilir. Bu yöntem, sıtma araştırmaları alanındaki, ilaç dirençli suşların genetik belirleyicileri nelerdir ve sıtmada bulaşabilirlik nedir gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Dondurulmuş kan evresi içeren iki şişedeki malaria parazitlerinin çaprazlanması için oda sıcaklığında bekletilmesi gerekir. Bu örnekte kullanılan iki kemirgen malaria paraziti suşu plasmodium yoi, oi ve plasmodiumdur. Yoi Nigerianlar, 22 ila 30 gauge iğne takılmış bir şırınga kullanarak 400 µL PBS pH 7.4 çekiniz; aynı şırıngayı kullanmaya devam ediniz.

Thor enfekte kanından 100 µL çekin, içerik homojen bir şekilde karışana kadar şırıngayı aşağı yukarı ters çevirin. Bu demonstrasyon sırasında, ağrı ve stresi en aza indirmek için anestezi uygulanmış hayvanlar kullanılacaktır. Anestezileme işlemi, bir farenin peritona 82.5 mg/kg ketamin ve 7.5 mg/kg ksilazin içeren 50 µL anestezik ilaç kokteyli enjekte edilerek gerçekleştirilir.

Anestezi derinliğini izlemek ve mortaliteyi önlemek için fareleri gözlemleyin. Bu prosedür kullanıldığında, fareler 20 ila 30 dakika boyunca anestezi altında kalacaktır. Derlenme öncesinde, 200 microliters parazit içeren çözeltiyi doğrudan bir farenin peritonuna enjekte edin.

İşlem tamamlandığında, şırıngayı tıbbi atık kesici-delici alet kutusuna atın. Bu yöntemi kullanarak, enjeksiyonlardan üç ila beş gün sonra, çaprazlanacak iki parazit suşunun her biriyle iki fareyi enfekte edin. Enfekte edilen farelerde kan aşaması parazitleri gelişecektir.

Farklı parazit suşları ile enfekte edilmiş donör farelerin kuyruk uçlarını steril makasla kesin. Bir mikroskop lamı üzerine bir damla fare kuyruk kanı alın ve ince yayma preparatlar hazırlayın. İnce kan yaymasını guillem boyası ile boyayın.

Guillem SA boyası, çekirdek eksikliği nedeniyle enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerini boyamaz; SAI ise enfekte kırmızı kan hücrelerindeki parazit çekirdeklerini boyayacaktır. Kırmızı kan hücreleri; ring evreleri, trofozoitler, şizontlar ve yırtılan merozoitler şeklinde görülür. Her iki farede de parazitemi %1 ile 5'e ulaştığında, karışık klon enfeksiyonu için kan evresi parazitleri toplanabilir.

Farklı parazitlerle enfekte edilmiş donör farelerin kuyruk uçlarını, daha önce açıklandığı şekilde steril makaslarla kesin. Cam bir kılcal tüp kullanarak bir mililitre steril PBS içinde bir mikrolitre fare kuyruk kanı toplayın. Alyuvar yoğunluğunu cell ome ile analiz etmek için kan süspansiyonunun 20 mikrolitresini kullanın.

Alyuvar yoğunluğu ve parazit ölçümlerini kullanarak, enfekte alyuvar konsantrasyonu 100 mikrolitrede 1 milyon olacak şekilde kan örneklerini fizyolojik sitratlı salin çözeltisi ile seyreltin. Karışık klon inokülumu elde etmek için iki donörden alınan enfekte kan örneklerini bire bir oranda birleştirin. Ardından, enfekte edilecek her farenin peritonuna karışık örnekten 100 mikrolitre enjekte edin.

Her ebeveyn suşun başarılı iletimini doğrulamak için tek klonlu enfeksiyonlarda iki fare kullanın. Parazitin erkek ve dişi gametosit olarak adlandırılan seksüel evreleri, enfeksiyondan yaklaşık dört gün sonra farelerin kanında görülmeye başlamalıdır. Daha önce açıklanan şekilde kuyruk kanı toplayıp ince kan yaymaları hazırlayarak, gametositlerin ortaya çıkışını izlemek için fareleri günlük olarak gözlemlemeye başlayın.

Erkek ve dişi sitler, büyük granüllerin veya pigmentlerin varlığı sayesinde ayırt edilebilir. Erkek gato sitlerinin sitoplazması pembe iken, dişi TER sitlerinin sitoplazması mavidir. Yalnızca olgun gato sitleri büyük bir vakuole sahiptir.

Her iki cinsiyetten olgun sitler tespit edildikten sonra, fareler sivrisinekleri beslemek için kullanılabilir. Her enfekte farenin peritona 50 microliters ketamin, ksilazin ve anestezik solüsyon enjekte edin. Fareler anestezi altına alındıktan sonra, bir tanesini 24 saat boyunca şeker kaynağıyla beslenmemiş 50 ila 100 dişi Anis defense enzyme sivrisineği içeren bir kafesin üzerine yüzüstü yerleştirin ve sivrisineklerin 30 dakika boyunca kesintisiz olarak beslenmesine izin verin.

Besleme döneminin hemen ardından fareleri insancıl yöntemlerle ötanize edin. Eğer transmisyon başarılıysa, beslemeden dokuz gün sonra, sivrisinekler tarafından alınan gametositler diploid zigotlara dönüşmüş ve bunlar da böceklerin orta bağırsağında görülebilen ookistlere olgunlaşmış olacaktır. Ne kadar çok ookist tespit edilirse, rekombinant parazitlerin üretilmiş olma ihtimali o kadar yüksektir.

Bir aspiratör kullanarak kafesten beş ila 10 enfekte sivrisinek toplayın ve sivrisinekleri küçük bir kaba aktarın. Sivrisinekleri karbondioksit gazı kullanarak anestezi edin ve buz üzerindeki cam bir Petri kabına aktarın. Antenleri dişilere göre belirgin şekilde daha tüylü olan erkek sivrisinekler ayıklanmalıdır.

İki şırıngayı PBS ile doldurun ve uçlarına 26 gauge yarım inçlik iğneler takın. Bir şırıngadan lam üzerine yaklaşık 100 µL PBS damlatın. Beş ila 10 adet anestezi uygulanmış dişi sivrisineği iğneleri kullanarak PBS damlasının üzerine aktarın ve lamı bir diseksiyon mikroskobuna yerleştirin.

Her bir sivrisineğin kanatlarını ve bacaklarını çıkarın, ardından böceği toraks ve posterior abdomenden tutun. Orta bağırsak (beyaz, kese benzeri bir yapı) serbest kalana kadar gövdeyi çekerek ayırın. Diseksiyon işlemi sırasında orta bağırsağı ayırın ve gövdenin geri kalanını atın.

Diseksiyon iğnelerindeki PBS'yi kullanarak orta bağırsakların nemli tutulduğundan emin olun. Diseksiyon tamamlandıktan sonra orta bağırsakların üzerine bir lamel yerleştirin. Orta bağırsakları bir ışık mikroskobu altında 100 kat büyütmede inceleyin.

OOS, orta bağırsakların dış yüzeyinde bulunan kalın duvarlı dairesel yapılar olarak tanınacaktır. Her bir orta bağırsaktaki OOS sayılarını sayın. Beslemeden 17 gün sonra, sistemden salınan sporozoitlerin sivrisineklerin SIV bezlerine göç etmiş olması gerekir, malaria parazitlerinin sporozoitleri.

Sporozoitleri toplamak için ince iğ şekilli hücreler kullanılır. İlk olarak, temiz bir makas kullanarak bir toplama tüpü hazırlayın. Küçük 500 µL'lik bir einor tüpün kapağını kesin.

Steril 19 gauge bir iğnenin ucunu ısıtın ve tüpün altına delik açın. Bir filtre oluşturmak için tüpün üçte birini cam duvarla doldurun. Filtre tüpünü daha büyük bir 1,5 mililitre einor tüpün içine yerleştirin.

Filtre aparatı hazır olduğunda, sivrisinekleri daha önce açıklandığı şekilde toplayın ve anestezi uygulayın. Böcekleri diseksiyon için daha önce yapıldığı gibi hava ile sabitleyin ve sivrisineklerin başlarını, kanatlarını, bacaklarını ve abdomenlerini çıkarın. Enfekte salivarya bezlerini sadece toraks içermektedir.

İnce uçlu pensler kullanarak toraksı, 500 µL PBS içeren 1,5 mL'lik bir homogenizatöre aktarın. Sporozoitlerin tükürük bezlerinden salınması için toraksı buz üzerinde homogenize edin ve bir cam pipet kullanarak homogenatları filtrasyon düzeneğine aktarın. Filtre tüpünü dakikada 1000 devirde 10 ila 20 saniye boyunca santrifüjleyin.

Homojenatlar santrifüjle çöktürüldükten sonra, 22 ila 30 gauge iğne takılı bir şırınga kullanarak süpernatantı toplayın. Sporozoit süspansiyonundan 100 ila 500 µL'yi bir farenin peritona enjekte edin. Enfeksiyondan üç gün sonra farelerin parazit ve alyuvar yoğunluğunu izlemeye başlayın.

Klonlama prosedürü için donör olarak, %0,1 ile %1 arasında parasitemi gösteren ve enfekte alyuvarlarının çoğunlukla tekli parazitler içerdiği bir fare seçin. Fareyle kuyruktan alınan kanı, 100 µL başına 0,6 ile 1 enfekte alyuvar konsantrasyonuna ulaşacak şekilde; soğuk, bire bir oranda buzağı serumu ve memeli Ringer çözeltisinden oluşan PBS dilüent ile seyreltip uygun miktarda kan çekin ve inokülumu buz üzerinde saklayın. Kuyruktaki enjeksiyon bölgesini etanolle temizleyerek intravenöz uygulama yapın.

100 fareye, her birine 100 µL seyreltilmiş enfekte kan enjekte edin. Bu şekilde, her bir fareye ya bir tane ya da hiç parazit bulaşmış olmalıdır. Başarılı bir deneyde, farelerin %20 ila %50'si sekizinci günde %0,1 ila %0,5 oranında parazitemi gösterecektir.

Beş ila yedi gün sonra, hazırlanmış ince kan yaymalarını inceleyerek farelerde kan evresi parazitlerin varlığını tarayın. Melezlemeden elde edilen yavru parazitler daha sonra, mikrosatellitler ve tek nükleotit polimorfizmleri gibi farklı kromozomlar üzerindeki genetik belirteçler kullanılarak, kuyruk kanı örneklerinden ekstrakte edilen DNA'nın PCR analizi ile genotiplenebilir. Bağımsız genetik lokusları iki ebeveyn klondan türemiş olan parazitler rekombinant klonlardır.

Rekombinant parazitlerle enfekte edilmiş hayvanlardan alınan kan, gelecekteki kullanımlar için kriyoprezerve edilebilir. Başarılı bir deneyde, toplam farelerin %5 ila %10'u bağımsız rekombinant progenyye sahip olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, sıtmadaki genetik sürecin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Parazit artı ortam yoi. Bu yöntem, diğer parazit türleri için de aynı şekilde uygulanabilir.