Name: Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Öğrenin, fare izole retinasında genetik etiketli ganglion hücrelerinden ışık tepkilerini kaydetme yöntemini. Bu teknik, hücre morfolojisini analiz ederek görsel işlemeyi anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133 hibe kısmen desteklenmiştir. Darwin&#39;in asın Biz onun teknik yardım için teşekkür ederim.

Hayvan Kullanım Bildirimi: Hayvanlar, Minnesota Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanan protokolleri kullanarak, Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu açıklanan kurallarına uygun olarak bakıldı . 1) Hazırlık çözümler <ol><li> Elektrofizyolojik kayıt yapmadan önce, hücre içi, ekstrasellüler ve enzim çözümleri hazırlıklı olması gerekiyor. </li><li> Ekstrasellüler çözüm: 1 litre ve 1.9 g sodyum bikarbonat (23 mM) ile H 2 O toz Ames 'orta karışımı bir şişe (8.8g) (Sigma). Bütün noktalarında ekstrasellüler çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 gaz karışımı ile doymuş yağlardır. 200 ml, retina depolama için bir behere aktarın. Yerçekimi perfüzyon için perfüzyon sistem konteyner retina monte sonra kalan çözüm yerleştirin. </li><li> Hücre içi çözüm: Hücre içi bir çözüm daha önce yapılan ve daha sonra aliquoted 500-1000 mcL alikotları ve -20 ° C'de saklanan olmalıdır Hücre içi bir çözüm biz Burada gösterilen akım pensi kayıtları (mM) için gerekli olan deney bağlı olarak değişir: 125 K-glukonat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 Hepes, 2 Na 2-ATP, 0.5 mM NaGTP KOH 5 ile 7.2 pH. 10 mcM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) gibi bir floresan tracer deney ve neurobiotin (% 0.3) sırasında dendritler görselleştirmek eklenebilir kayıt aşağıdaki hücre anatomisi analizi için dahil edilebilir. Kaydetmek için hazır olduğunuzda, hücre içi çözüm Çözülme. </li><li> Enzim çözüm: 10000 Birimleri kollajenaz (Worthington Kimyasallar) ekstrasellüler çözüm 4.150 ml içine 83 mg Hyaluronidase (Worthington Kimyasallar) ile birleştirin. -20 ° C'de 50 mcL alikotları saklayın Alikot birkaç hafta için kullanılabilir. Retina tedavi etmek için hazır olduğunuzda, kabarmış ekstrasellüler çözüm 500 mcL kısım seyreltilmiş. </li><li> Fosfat Çözümü (PBS) Tamponlu: 800 mL H 2 O 8 g NaCl, KCl, 0.2 g Na 2 HPO 4, 1.4 g ve 0.24 g KH 2 PO 4 ekleyin. NaOH ile pH 7.4 'e getirin. 1 L. ses seviyesini ayarlayın </li><li> 0.2 M Fosfat Tampon: 800 ml H 2 O, Na 2 HPO 4 21.8 g ve 6.4 g NaH 2 PO 4 ekleyin. 1 L. hacim getir </li><li> % 4 Paraformaldehit Çözüm: Isı 60 ila 50 ml H 2 O ° C 4g paraformaldehid ekleyin ve birkaç dakika daha çırpın. 1M NaOH birkaç damla (yaklaşık 5 damla), çözüm açıktır kadar karıştırmaya devam edin. Behere 50 ml 0.2 M fosfat tamponu ekleyin. PH şeritleri (~ 7.4) ile pH kontrol edin. Filtre ve serin. </li><li> Engelleme solüsyonu (% 10 keçi serumu,% 0.5 'TritonX100): keçi serum ve 10 mcL Triton X-100 0.2 ml 1.8 ml PBS ekleyin. TritonX-100 doku permeabilise hizmet vermektedir. </li><li> Streptavidin solüsyonu (% 5 keçi serumu,% 0.5 'TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): 1.9 ml PBS keçi serum 0.1 ml, 10 mcL Triton X-100 ve 4 Streptavidin 594 mcL ekleyin. </li></ol> 2) İzolasyon fare retinanın Gerekli Diseksiyon araçları: 1 # 2 Forseps, 2 # 5 Forseps, oftalmolojik makas <ol><li> Bu durumda, onaylanmış protokollere göre fare Euthanize CO 2 boğulma ve aydınlatmak göz küresi, göz arkasında bir kesik # 2 forseps yavaşça ekleme ve göz küresi dışarı kaldırma . </li><li> Göz küresi ekstrasellüler çözümü ile 35 mm Petri kabı içine yerleştirin. Optik sinir ve oftalmolojik makas kullanarak herhangi bir bağlı ekstraoküler kasların veya bağ dokusu kesin. Oftalmolojik bir makas ile kesip kornea ve lens # 5 forseps kullanarak çekin. # 5 forseps bir çift kullanarak sklerasına Gözyaşı ve, retina ve sklera optik disk buluşmak optik sinir koparmak için forseps kullanabilir. Göz yuvası uzak retinanın hafifçe kabuğu. İpucu: süresini en aza indirmek için bir sonraki adıma geçmeden önce, hem de retina her adım yapın. </li><li> Forseps retinaya bağlı vitreus kaldırmak için kullanın. Bu forseps ile retina üzerinde şeffaf vitreus "kapma" yapılabilir. Vitreus, eğer başarıyla kaldırıldı, forseps açık bir, jelatinimsi bir madde olarak görünür olmalıdır. İpucu: vitreus yarım aşağıdaki kaldırma retina Dilimleme kullanılabilir doku miktarı en üst düzeye çıkarmak ve daha kolay odasının montajı yapacak. </li><li> Sindirilmiş olmak için hazır olana kadar minimum ortam ışığı ile karanlık bir ortamda oda sıcaklığında oksijenli ekstrasellüler çözüm retina tutun. Retinanın ~ 6 saat boyunca bu şekilde saklanabilir. </li></ol> 3) retinanın enzim karışımı ile kayıt odasında Tedavi ve montaj <ol><li> 35 mm Petri kabındaki 500 mcL ekstrasellüler çözüm, yerinde çözüm kollajenaz / hiyalüronidaz bir kısım seyreltilir ve retina transferi. </li><li> Retina içeren tutunyavaşça sallanarak 15 dakika için% 95 O2 /% 5 CO 2 ortamında ing Petri kabı, kapalı ve karanlık. Bu adım, kalan vitreus sindirerek yardımcıları ve ganglion hücre tabakası kolay erişim sağlar. İpucu: daha az vitreus veya olumsuz etkileri gözlenmiştir genç hayvanlardan elde edilen retina, süresi ~ 5 dakika kısaltılabilir. </li><li> Enzim içeren orta retina çıkarın ve ekstrasellüler çözümü iyice yıkayın. </li><li> Retinanın fotoreseptör tabakası ile aşağı bakacak şekilde kamara 6 kayıt içine aktarın. Bir pipet veya doku ya da sıvı kalan uzak Wick ve retina ganglion hücre tabakası ile özellikle temastan kaçınarak sadece kenarları, dokunmaya doku düzleştirmek için retinanın kenarlarında dışarı rulo. Doku çapa ve ekstrasellüler çözüm odasının hemen doldurmak için retina üzerinde naylon örgü ile platin yüzük yerleştirin. </li><li> Mikroskop sahneye Mount kayıt odası, yerçekimi perfüzyon ve vakum emiş tüpü takmak ve topraklama kablosu takın. </li></ol> 4) EGFP ifade ganglion hücrelerinin Yerelleştirme ve hafif stimülasyon <ol><li> 1 ml / dakika ya da daha hızlı bir fiyatla ekstrasellüler çözümü ile yerçekimi retina serpmek. İpucu: perfüzyon hızı çok yavaş ise, doku yeterince oksijenli ve sinaptik sinyal bozulabilir olmayacaktır. </li><li> Hücre içi solüsyonu ile doldurun ve bir kayıt pipet pipet tutucu takın. İpucu: 3 5MΩ aralığında dirençleri ile Pipetler iyi sonuçlar verebilir. </li><li> Kayıt pipet yerelleştirilmesine düşük büyütme (10X amacı, NA 0.3) kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik altında retina gözünüzde canlandırın. Kızılötesi ışık, görünür ışığın retinada maruziyeti en aza indirmek ve ışık adaptasyon en aza indirmek için kullanılır. Yüksek büyütme (40X amacı, NA 0.8) taşı ve doku yukarıda sadece görünümü içine elektrod getirmek. </li><li> Yüksek büyütme (40X objektif), Epifloresans (EGFP için 480 nm) ile retina aydınlatmak ve bant (Şekil 1A) kullanarak bilgisayar monitörü floresan bir ganglion hücre ve işareti seçin. </li><li> DIC ve kızılötesi aydınlatma altında, kayıt elektrodu hedeflenen ganglion hücresi (Şekil 1A) yakın pozisyon. Temizlik alanında hemen kayıt elektrot, polietilen boru ile pipet sahibine bağlı bir 12cc plastik enjektör ile hafif pozitif basınç uygulayarak hücre kapsayan. Amplifikatör, herhangi bir gerilim uzaklıklar sıfır. Yeri elektrot seçilen ganglion hücre üzerine gamze hücre yüzeyinde görünene kadar. </li><li> Gerilim kelepçe modunda amplifikatör, bir test darbe uygulamak ve pipet akımını geçirerek izlemek. Elektrot ve hücre arasındaki mühür oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Negatif basınç, hücre, hücre zarı ve pipet arasındaki GΩ elektrik mühür akım göstergesidir tutarak kadar mühür ve bekleyin başladığında bırakın. Kapasitif transientler görünür ve daha sonra basınç herhangi bir uygulama bırakana kadar nazik bakliyat negatif basınç uygulayın. İpucu: erişim (seri) direnci yüksek ise (&gt; 30MΩ), bu genellikle, negatif basınç ek, çok nazik, bakliyat tarafından ıslah edilebilir. </li><li> Bir istikrarlı bir mühür, bir darbe negatif basınç uygulamak ulaşıldı. Tüm hücre modu elde edildikten sonra, hücre karanlık 5 dakika boyunca uyum sağlar. Kayıt, tam alan, beyaz ışık stimülasyonu (Şekil 1B) akım pensi modu, tepki. </li><li> Kayıt sonrasında Alexafluor-594 dendritler yayılmış olacaktır. 594 nm Epifloresans altında tracer görüntülenebilmekte ve ganglion hücre olup olmadığını On-Epifloresans ve DIC kızılötesi optik 5 arasında geçiş Off-ya da Bi-tabakalı belirlemek için kullanılır. </li><li> Pipet ve retina immünohistokimya için işlenmiş olacak neurobiotin dahil ise, o zaman pipetle yavaşça zarının en az kesilme sağlamak için retrakte olmalıdır. </li></ol> 5) Analiz kaydedilen ganglion hücrelerinin anatomisi Neurobiotin ile doldurma kayıt sonrasında ganglion hücrelerinin daha ayrıntılı morfolojik analiz sağlar. İpucu: kaydedilmiş bir ganglion hücre ve detaylı morfolojisi arasındaki özel ilişki isteniyorsa, bu hazırlık için sadece RGC bir kayıt ve doldurmak için en iyisi olabilir. <ol><li> Neurobiotin hücre içi bir çözüm dahil edildi, sonra paraformaldehid çözüm retina yerleştirmek ve 4 gece düzeltmek ° C </li><li> PBS içinde, en az 6 değişiklikler en az 2 saat durulayın. Engelleme çözümü içeren bir tabak retina aktarın. Shaker, 2 saat boyunca oda sıcaklığında çözümü engelleme bekletin. </li><li> Streptavidin çözümü ile engelleme çözüm değiştirin. 2 gün, 4 ° C çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. PBS içinde retina, 6 çalkalama, her biri 20 dakika durulayın. </li><li> Bir bardak slayt Vectashield retina monte edin.Retina ganglion hücrelerinin yerleştirilmesi gerekir. Konfokal mikroskobu (Şekil 1C) gerçekleştirin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Retinanın sağlıklı ve diseksiyon başarılı olursa, bireysel ganglion hücrelerinin yüksek büyütme (Şekil 1A) DIC altında görünür olmalıdır. Sağlıksız retina büyük, toz çekirdekleri ve atılmalıdır. Belirli bir ganglion hücre sinaptik yanıt sağlam ise, o hücrenin bir içsel ışığa ganglion hücresi (Şekil 1B), sürekli bir depolarizasyon durumunda, ışık başlangıcında yanıt vermek ya da aksiyon potansiyelleri ile ofset ve olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Yerelleştirme, kayıt, ve bir floresan etiketli retina ganglion hücre boyama (A) GFP pozitif RGC 40X büyütme (sol panel) ve DIC aydınlatma (sağ panel) altında epifluorescent aydınlatma altında görüntülendi. (B) floresan etiketli RGC tüm hücre akım kelepçe modunda kaydedilen M2 özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücre Synaptic ışık yanıt. (C) tüm hücre kayıt için hedeflenen Epifloresans altında tespit edilmiştir M1 özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücre, neurobiotin dolu ve ardından immünohistokimya için işlenmiş.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

Bu teknik, izole bir retina herhangi bir retina ganglion hücre kayıtları geçerlidir. Yukarıda kullanılan fare doğrultusunda rağmen özünde ışığa, melanopsin ifade RGCs EGFP 2, 5 ile etiketlenir, bu protokol floresan ile işaretlenmiş diğer RGC hatları kolayca devredilemez veya yanı sıra rastgele seçilen RGCs kayıt jeneralize olabilir. Bu teknik, her RGC ve ilgili giriş nöronların dendritik mili tamamen değişmeden kalır, çünkü özellikle değerlidir. Kayıtları, akım veya gerilim kelepçe modları, yapılandırma hücre...

<table><tbody><tr><td>Ames&amp;rsquo; Besiyeri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaz</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hiyaluronidaz</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 Hidrazid</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Nörobiyotin</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>Elektrotlar</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmologik Makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

genetik etiketli retina ganglion hücreleri işık tepkisi record İzole retina hazırlık

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Işık retina 1 çubuk ve koni fotoreseptörlerin uyarır, omurgalı vizyonu ilk adımları yer almaktadır. Bu bilgiler daha sonra ON ve OFF yollar olarak bilinen ayrılmış;. Bipolar hücreler, ışık şiddeti artar (BCS Açık) veya azalır (BCS Kapalı) yanıt olarak depolarize fotoreseptörlerin sinyal ışık bilgi (BCS). Işık bilgi bu ayrımı Kapalı BCS doğrudan eksitatör giriş alırsınız iç pleksiform katman (IPL), ya da Kapalı sublamina tabakalandırılması dendritler retina ganglion hücrelerinin (RGCs) seviyesinde tutulur, ya da içinde tabakalandırılması BCS Açık doğrudan eksitatör giriş alırsınız IPL Açık sublamina. Aydınlatma (Açık ve Kapalı yollar) olarak artar veya azalır ile ilgili bilgiler bu ayrımı paralel olarak korunmuş ve beyne sinyal. RGCs retinanın çıkış hücreleri, ve böylece ışık bilgileri beynin görme çekirdekleri sinyal nasıl anlamak için çalışma önemli bir hücre. Son on yılda fare genetik gelişmeler, özel RGC nüfus elektrofizyolojik kayıt için hedef RGC alt tipleri 2 3 4 ve özel kimlik izin vermek için floresan protein etiketli floresan muhabiri fare hatları çeşitli sonuçlandı . Burada, sağlam bir, izole retinal hazırlanmasında floresan etiketli ganglion hücrelerinin ışık yanıtları kaydetmek için bir yöntem mevcut. Bu izole retinal dendritik mili sağlam ve tüm RGC dendritik mili boyunca girişler korunur RGCs kayıtları için hazırlık sağlar. Bu yöntem, ganglion hücre alt tiplerinin çeşitli çapında geçerli ve tek hücreli fizyolojik teknikler geniş bir yelpazede uygun.

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Omurgalı görmesinin ilk adımları, ışığın retinanın çomak ve koni fotoreseptörlerini uyardığında gerçekleşir 1. Bu bilgi daha sonra...

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş fare retinasındaki genetik olarak işaretlenmiş ganglion hücrelerinden ışıkla uyarılan yanıtları kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle retinanın fare gözünden diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kalan vitreusu uzaklaştırmak için retinanın enzim ile işleme tabi tutulmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, retinayı ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde kayıt odasına yerleştirmek, odayı mikroskop tablasına monte etmek ve genetik olarak işaretlenmiş ganglion hücrelerini tanımlamaktır. Prosedürün son adımı ise, tanımlanan ganglion hücresinden tüm hücre kaydı almak ve ışıkla uyarılmış yanıtları kaydetmektir. Nihayetinde, tek hücreli patch clamp kayıtları aracılığıyla fare retinasındaki belirli bir ganglion hücresi tipinin fonksiyonel özelliklerini gösteren ve bu hücrenin beyne ilettiği sinyalleri tanımlayan sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, benim adım Tiffany Schmidt ve Minnesota Üniversitesi'nde Dr. Paulo Ka Fuji'nin laboratuvarında nörobilim alanında yüksek lisans öğrencisiyim. Bu teknik, tanımlanmış, genetik olarak etiketlenmiş bir ganglion hücresi popülasyonunun tanımlanmasına ve bunlardan kayıt alınmasına ve ardından morfolojik analize olanak tanır. Bu teknik, cerrahi işlemi gerçekleştirmeden önce, farklı ganglion hücresi alt tiplerinin görsel uyaranların temel özelliklerini nasıl işlediği gibi görsel alanla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Retinayı çıkarmak için ilk görev, deney için gerekli olan sekiz çözeltiyi hazırlamaktır. Bu deneyde kullanılan tüm çözeltilerin bileşenleri beraberindeki metinde verilmiştir. Retina saklama işlemi için 200 mililitre hücre dışı çözeltiyi 250 mililitrelik bir behere aktarın.Kayıt sırasında yerçekimi ile perfüzyon sağlamak için kalan hücre dışı çözeltiyi bir ayırma hunisine yerleştirin. Bu çözeltilerin her ikisi de her zaman %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile doyurulmuş durumda tutulmalıdır. Deney sırasında dendritleri görüntülemek için, hücre içi çözeltiye LOR 5 94 gibi floresan bir izleyici ekleyin.Tüm hücre kaydından sonra immünohistokimya yapmayı planlıyorsanız, hücre içi solüsyona %0,3 neuro biotin ekleyin. Gerekli solüsyonlar hazırlandıktan sonra, bir fareyi karbondioksit asfiksisi ile ötanize edin; açılı 2 numara forsepi nazikçe gözün arkasına yerleştirip göz küresini kaldırarak çıkarın. Ekstraoküler kasları temizlemek ve optik siniri kesmek için oftalmolojik makas kullanın.Göz küresini, hücre dışı solüsyonla doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Korneayı oftalmolojik makasla kesin ve lensi 5 numara forseps kullanarak çıkarın. Sklera tabakasını yırtmak ve retina ile skleranın birleştiği noktadaki kalan optik siniri kesmek için 5 numara forseps kullanın.Pensleri retina ve sklera arasındaki boşlukta hareket ettirerek retinayı göz çukurundan nazikçe ayırın. Zaman kazanmak için, bir sonraki adıma geçmeden önce her adımı her iki retinada da uygulayın; retinaya yapışık olan vitreusunun temizlenmesi kritik bir adımdır. Retinanın üzerindeki şeffaf vitreusu pensle tutarak işleme başlayın.Vitreus başarıyla çıkarıldığında, pensetin ucunda küçük, şeffaf jelatinöz bir madde göreceksiniz. Kullanılabilir doku miktarını maksimize etmek ve retinanın kayıt haznesine yerleştirilmesini kolaylaştırmak için her bir retinayı ortadan ikiye bölün. Retinaları oda sıcaklığındaki oksijenlendirilmiş hücre dışı çözeltiye yerleştirin ve yalnızca bilgisayar ekranlarından gelen ışık gibi minimum ortam ışığına izin vererek ışığa maruz kalmayı en aza indirin; retinalar yaklaşık altı saat boyunca canlı kalır.Diseksiyonun ardından, ekstra retinaların bulunduğu çözeltiden 500 µL hücre dışı çözelti alın. İçine kollagenaz hiyaluronidaz enzim çözeltisinden bir alikot ekleyerek seyreltin.Enzim çözeltisini 35 milimetrelik bir Petri kabına koyun ve diseke edilen retinalardan birini Petriye aktarın. Petri kabını 15 dakika boyunca sürekli olarak döndürün ve çözeltiye nazikçe %95 oksijen, %5 karbondioksit verin. Enzim çözeltisi, kalan vitreus dokusunu uzaklaştırarak gangliyon hücre tabakasına daha kolay erişim sağlar. Daha az vitreusa sahip genç hayvanlardan alınan retinalar için veya advers etkiler gözlemlendiğinde, sindirim süresi beş dakikaya indirilebilir.Ucu kesilmiş plastik bir transfer pipeti kullanın. Retinayı enzim içeren ortamdan çıkarın. Retinayı hücre dışı solüsyonda kapsamlı bir şekilde yıkayın.Retinayı kayıt haznesine aktarın. Fotoreseptör tabakası aşağı bakacak şekilde, kalan tüm sıvıyı bir pipet veya doku yardımıyla emdirin ve dokuyu düzleştirmek için retinanın kenarlarını dışa doğru açın. Retinanın sadece kenarlarına dokunmaya, ganglion hücre tabakasına dokunmamaya dikkat edin.Retinayı sabitlemek için, retinanın üzerine naylon ağlı bir platin halka yerleştirin ve ardından hücre odasını hemen hücre dışı çözelti ile doldurun. Kayıt odasını mikroskop tablasına monte edin; ardından hücre dışı çözeltinin yerçekimi ile perfüzyonu için kullanılan tüpü, vakum emme tüpünü ve toprak hattını bağlayın. Yerçekimi ayarını, çözeltinin dakikada 1 ml veya daha hızlı damlayacak şekilde düzenleyin.Perfüzyon hızı çok düşük olursa, doku yeterince oksijenlenmeyecek ve sinaptik sinyalleşme bozulabilecektir. Bir sonraki adım, tüm hücre yama kaydı (whole cell patch recording) için elektrodu hazırlamaktır. Üç ila beş mega ohm aralığında dirence sahip bir pipet seçiniz.Kayıt pipetini, çözütülmüş bir hücre içi solüsyon alikotuyla doldurun ve 10 x objektif altında, kızılötesi aydınlatma ile diferansiyel girişim kontrastı veya DIC optiği kullanarak pipet tutucuya yerleştirin. Retinayı ve kayıt pipetini görüntüleyin. Kızılötesi ışık, retinanın görünür ışığa maruz kalmasını ve ışık adaptasyonunu en aza indirmek için kullanılır; 40 x objektife geçin ve elektrodu dokunun hemen üzerinde görünecek şekilde getirin.Bu çalışmada kullanılan fare hattı, ganglion hücrelerinde EGFP eksprese eder ve bu nedenle ganglion hücreleri epi-floresan altında görülebilir. Mikroskopi, retinayı 480 nanometrede epi-floresan ile aydınlatır. Retina sağlıklıysa, tekil ganglion hücreleri görünür olmalıdır.Sağlıksız retinalarda büyük granüllü çekirdekler bulunur ve bunlar elenmelidir. Kayıt için floresan ganglion hücrelerinden birini seçin ve seçilen hücreyi bilgisayar monitörü üzerinde işaretlemek için laboratuvar bandı kullanın. Seçilen ganglion hücresi gövdesi görünür hale gelecek şekilde kızılötesi optiklere geçiş yapın.Kayıt elektrodunu hedeflenen ganglion hücresinin yakınına konumlandırın. Kayıt elektroduyla hafif pozitif basınç uygulayarak, hücreyi hemen çevreleyen alanı temizleyin. Elektrot basıncı, amplifikatör sıfırında bulunan polietilen tüplerle pipet tutucuya bağlanmış 12 cc'lik plastik bir şırınga aracılığıyla uygulanır.Her türlü voltaj sapması. Elektrodu, hücre yüzeyinde bir çöküntü oluşana kadar seçilen ganglion hücresinin üzerine yerleştirin. Amplifikatör voltaj klemp modundayken, bir test darbesi uygulayın ve pipetten geçen akımı izleyin.Elektrot ve hücre arasında bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Sızdırmazlık oluşmaya başladığında negatif basıncı serbest bırakın ve tutma akımı, hücre membranı ile pipet arasında giga elektriksel sızdırmazlık oluştuğunu gösterene kadar bekleyin. Tüm hücre kayıt moduna geçildiğini belirten kapasitif geçişler görünene kadar hafif negatif basınç darbeleri uygulayın ve ardından uygulanan tüm basıncı serbest bırakın.Eğer erişim direnci 30 mega ohm'dan büyükse, bu durum genellikle ek ve çok hafif negatif basınç darbeleriyle iyileştirilebilir. Tüm hücre modu elde edildikten sonra, kızılötesi ışığı kapatın ve mikroskobu siyah bir bezle örtün. Hücrenin beş dakika boyunca karanlığa adapte olmasını sağlayın.Beş dakika sonra, preparat kayıt için hazır hale gelir. Akım klempi modunda, tam alan beyaz ışık stimülasyonunu açın ve ganglion hücresinin yanıtını kaydedin. Ganglion hücresine birden fazla kez stimülasyon uygulanacaksa, stimülasyonlar arasında retinanın gerektiği kadar karanlığa adapte olmasına izin verilmelidir.Kayıt sonrası ganglion hücresi yanıt özelliklerini değerlendirmek amacıyla, ışık uyaranı bu noktada desenli veya kromatik uyaranları içerecek şekilde değiştirilebilir; hücre içi solüsyondaki floresan izleyici, epi floresan ve DIC kızılötesi optikler arasında geçiş yapılarak dendritlere yayılmış olacaktır. İzleyici, 594 nanometrede epi floresan altında görselleştirilebilir ve ganglion hücresinin "açık", "kapalı" veya "tabakalı" (stratified) olup olmadığını belirlemek için dendritler incelenebilir. Hücre içi solüsyona eklenen nörobiyotin ganglion hücresine yayılmıştır, bu nedenle bir sonraki adım retinayı immünohistokimya için hazırlamaktır.Hücre membranındaki bozulmayı en aza indirmek için pipeti nazikçe geri çekin. Her preparasyon için yalnızca bir retinal ganglion hücresini kaydedip doldurursanız, kaydedilen ganglion hücresi ile detaylı morfolojisi arasında spesifik korelasyonlar kurabileceğinizi unutmayın. Ardından, retinayı Paraform aldehit çözeltisine yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyerek fiksasyon işlemini tamamlayın.Fikse edilmiş retinayı, iki veya daha fazla saat boyunca PBS çözeltisini en az altı kez değiştirerek PBS ile durulayın. Durulama işleminden sonra retinayı bloklama çözeltisi içeren bir plakaya aktarın, plakayı bir çalkalayıcıya yerleştirin ve iki saat boyunca bekletin. Oda sıcaklığında, bloklama çözeltisini strep kanıt çözeltisi ile değiştirin, retinayı tekrar çalkalayıcıya yerleştirin ve 4 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.İki gün sonra, retinayı monte etmek için her biri 20 dakika süren altı kez PBS ile durulayın. Retinayı, vector shield kullanarak bir lam üzerine ganglion hücre tabakası üste gelecek şekilde yerleştirin. Montaj ortamını bir lamellen ile kapatın ve oje ile mühürleyin; etiketlenmiş ganglion hücreleri artık bir konfokal mikroskop altında incelenebilir.Bu şekil, solda 40 kat büyütmede epi floresan aydınlatma altında ve sağda DIC aydınlatma altında görüntülenen GFP pozitif retinal ganglion hücrelerini göstermektedir. Retina sağlıklıysa ve diseksiyon başarılı olduysa, yüksek büyütmedeki DIC altında tekil ganglion hücreleri görünür. Sağlıksız retinalarda büyük granüllü çekirdekler bulunur ve bunlar atılmalıdır.Bu şekil, katmanlaşmış intrinsik olarak fotosensitif retinal ganglion hücresi M2 için tipik olan ışık yanıt türünü göstermektedir. Belirli bir preparatta genetik olarak işaretlenmiş retinal ganglion hücresinin türüne bağlı olarak, yanıt özellikleri farklılık gösterecektir. Eğer belirli bir ganglion hücresinin sinaptik yanıtı sağlamsa, hücre ışık başlangıcında veya bitişinde aksiyon potansiyelleriyle yanıt vermelidir.İçsel olarak foto-hassas bir ganglion hücresinde sürekli bir depolarizasyon durumunda, nörobiyotin ile doldurulmuş bir ganglion hücresinin bu şekli, tipik bir M1 off katmanlaşan, içsel olarak foto-hassas retinal ganglion hücresinin morfolojisini göstermektedir. Tüm hücre kaydının ardından yapılan immünohistokimya, dendritik morfoloji ile retinal ganglion hücresinin elektrofizyolojik yanıtı arasında bir korelasyon kurulmasına olanak tanır. Bu prosedürü uygularken, sinaptik yanıtları korumak için retinal kuyucuğu oksijenlendirmeyi ve dokuyu hızla perfüze etmeyi hatırlamak önemlidir.Bu gösterimi izlediğiniz için teşekkür ederiz.

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video su kaplan semender retina dilim tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları süreci gösterir. Biz yanı sıra retinanın görsel uyarılma sırasında yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl dilim hazırlık göstermektedir.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Öğrenin, fare izole retinasında genetik etiketli ganglion hücrelerinden ışık tepkilerini kaydetme yöntemini. Bu teknik, hücre morfolojisini analiz ederek görsel işlemeyi anlamaya yardımcı olur.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Daha fazla video keşfet