Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş fare retinasındaki genetik olarak işaretlenmiş ganglion hücrelerinden ışıkla uyarılan yanıtları kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle retinanın fare gözünden diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kalan vitreusu uzaklaştırmak için retinanın enzim ile işleme tabi tutulmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, retinayı ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde kayıt odasına yerleştirmek, odayı mikroskop tablasına monte etmek ve genetik olarak işaretlenmiş ganglion hücrelerini tanımlamaktır. Prosedürün son adımı ise, tanımlanan ganglion hücresinden tüm hücre kaydı almak ve ışıkla uyarılmış yanıtları kaydetmektir. Nihayetinde, tek hücreli patch clamp kayıtları aracılığıyla fare retinasındaki belirli bir ganglion hücresi tipinin fonksiyonel özelliklerini gösteren ve bu hücrenin beyne ilettiği sinyalleri tanımlayan sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, benim adım Tiffany Schmidt ve Minnesota Üniversitesi'nde Dr. Paulo Ka Fuji'nin laboratuvarında nörobilim alanında yüksek lisans öğrencisiyim. Bu teknik, tanımlanmış, genetik olarak etiketlenmiş bir ganglion hücresi popülasyonunun tanımlanmasına ve bunlardan kayıt alınmasına ve ardından morfolojik analize olanak tanır. Bu teknik, cerrahi işlemi gerçekleştirmeden önce, farklı ganglion hücresi alt tiplerinin görsel uyaranların temel özelliklerini nasıl işlediği gibi görsel alanla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Retinayı çıkarmak için ilk görev, deney için gerekli olan sekiz çözeltiyi hazırlamaktır. Bu deneyde kullanılan tüm çözeltilerin bileşenleri beraberindeki metinde verilmiştir. Retina saklama işlemi için 200 mililitre hücre dışı çözeltiyi 250 mililitrelik bir behere aktarın.

Kayıt sırasında yerçekimi ile perfüzyon sağlamak için kalan hücre dışı çözeltiyi bir ayırma hunisine yerleştirin. Bu çözeltilerin her ikisi de her zaman %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile doyurulmuş durumda tutulmalıdır. Deney sırasında dendritleri görüntülemek için, hücre içi çözeltiye LOR 5 94 gibi floresan bir izleyici ekleyin.

Tüm hücre kaydından sonra immünohistokimya yapmayı planlıyorsanız, hücre içi solüsyona %0,3 neuro biotin ekleyin. Gerekli solüsyonlar hazırlandıktan sonra, bir fareyi karbondioksit asfiksisi ile ötanize edin; açılı 2 numara forsepi nazikçe gözün arkasına yerleştirip göz küresini kaldırarak çıkarın. Ekstraoküler kasları temizlemek ve optik siniri kesmek için oftalmolojik makas kullanın.

Göz küresini, hücre dışı solüsyonla doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Korneayı oftalmolojik makasla kesin ve lensi 5 numara forseps kullanarak çıkarın. Sklera tabakasını yırtmak ve retina ile skleranın birleştiği noktadaki kalan optik siniri kesmek için 5 numara forseps kullanın.

Pensleri retina ve sklera arasındaki boşlukta hareket ettirerek retinayı göz çukurundan nazikçe ayırın. Zaman kazanmak için, bir sonraki adıma geçmeden önce her adımı her iki retinada da uygulayın; retinaya yapışık olan vitreusunun temizlenmesi kritik bir adımdır. Retinanın üzerindeki şeffaf vitreusu pensle tutarak işleme başlayın.

Vitreus başarıyla çıkarıldığında, pensetin ucunda küçük, şeffaf jelatinöz bir madde göreceksiniz. Kullanılabilir doku miktarını maksimize etmek ve retinanın kayıt haznesine yerleştirilmesini kolaylaştırmak için her bir retinayı ortadan ikiye bölün. Retinaları oda sıcaklığındaki oksijenlendirilmiş hücre dışı çözeltiye yerleştirin ve yalnızca bilgisayar ekranlarından gelen ışık gibi minimum ortam ışığına izin vererek ışığa maruz kalmayı en aza indirin; retinalar yaklaşık altı saat boyunca canlı kalır.

Diseksiyonun ardından, ekstra retinaların bulunduğu çözeltiden 500 µL hücre dışı çözelti alın. İçine kollagenaz hiyaluronidaz enzim çözeltisinden bir alikot ekleyerek seyreltin.

Enzim çözeltisini 35 milimetrelik bir Petri kabına koyun ve diseke edilen retinalardan birini Petriye aktarın. Petri kabını 15 dakika boyunca sürekli olarak döndürün ve çözeltiye nazikçe %95 oksijen, %5 karbondioksit verin. Enzim çözeltisi, kalan vitreus dokusunu uzaklaştırarak gangliyon hücre tabakasına daha kolay erişim sağlar. Daha az vitreusa sahip genç hayvanlardan alınan retinalar için veya advers etkiler gözlemlendiğinde, sindirim süresi beş dakikaya indirilebilir.

Ucu kesilmiş plastik bir transfer pipeti kullanın. Retinayı enzim içeren ortamdan çıkarın. Retinayı hücre dışı solüsyonda kapsamlı bir şekilde yıkayın.

Retinayı kayıt haznesine aktarın. Fotoreseptör tabakası aşağı bakacak şekilde, kalan tüm sıvıyı bir pipet veya doku yardımıyla emdirin ve dokuyu düzleştirmek için retinanın kenarlarını dışa doğru açın. Retinanın sadece kenarlarına dokunmaya, ganglion hücre tabakasına dokunmamaya dikkat edin.

Retinayı sabitlemek için, retinanın üzerine naylon ağlı bir platin halka yerleştirin ve ardından hücre odasını hemen hücre dışı çözelti ile doldurun. Kayıt odasını mikroskop tablasına monte edin; ardından hücre dışı çözeltinin yerçekimi ile perfüzyonu için kullanılan tüpü, vakum emme tüpünü ve toprak hattını bağlayın. Yerçekimi ayarını, çözeltinin dakikada 1 ml veya daha hızlı damlayacak şekilde düzenleyin.

Perfüzyon hızı çok düşük olursa, doku yeterince oksijenlenmeyecek ve sinaptik sinyalleşme bozulabilecektir. Bir sonraki adım, tüm hücre yama kaydı (whole cell patch recording) için elektrodu hazırlamaktır. Üç ila beş mega ohm aralığında dirence sahip bir pipet seçiniz.

Kayıt pipetini, çözütülmüş bir hücre içi solüsyon alikotuyla doldurun ve 10 x objektif altında, kızılötesi aydınlatma ile diferansiyel girişim kontrastı veya DIC optiği kullanarak pipet tutucuya yerleştirin. Retinayı ve kayıt pipetini görüntüleyin. Kızılötesi ışık, retinanın görünür ışığa maruz kalmasını ve ışık adaptasyonunu en aza indirmek için kullanılır; 40 x objektife geçin ve elektrodu dokunun hemen üzerinde görünecek şekilde getirin.

Bu çalışmada kullanılan fare hattı, ganglion hücrelerinde EGFP eksprese eder ve bu nedenle ganglion hücreleri epi-floresan altında görülebilir. Mikroskopi, retinayı 480 nanometrede epi-floresan ile aydınlatır. Retina sağlıklıysa, tekil ganglion hücreleri görünür olmalıdır.

Sağlıksız retinalarda büyük granüllü çekirdekler bulunur ve bunlar elenmelidir. Kayıt için floresan ganglion hücrelerinden birini seçin ve seçilen hücreyi bilgisayar monitörü üzerinde işaretlemek için laboratuvar bandı kullanın. Seçilen ganglion hücresi gövdesi görünür hale gelecek şekilde kızılötesi optiklere geçiş yapın.

Kayıt elektrodunu hedeflenen ganglion hücresinin yakınına konumlandırın. Kayıt elektroduyla hafif pozitif basınç uygulayarak, hücreyi hemen çevreleyen alanı temizleyin. Elektrot basıncı, amplifikatör sıfırında bulunan polietilen tüplerle pipet tutucuya bağlanmış 12 cc'lik plastik bir şırınga aracılığıyla uygulanır.

Her türlü voltaj sapması. Elektrodu, hücre yüzeyinde bir çöküntü oluşana kadar seçilen ganglion hücresinin üzerine yerleştirin. Amplifikatör voltaj klemp modundayken, bir test darbesi uygulayın ve pipetten geçen akımı izleyin.

Elektrot ve hücre arasında bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Sızdırmazlık oluşmaya başladığında negatif basıncı serbest bırakın ve tutma akımı, hücre membranı ile pipet arasında giga elektriksel sızdırmazlık oluştuğunu gösterene kadar bekleyin. Tüm hücre kayıt moduna geçildiğini belirten kapasitif geçişler görünene kadar hafif negatif basınç darbeleri uygulayın ve ardından uygulanan tüm basıncı serbest bırakın.

Eğer erişim direnci 30 mega ohm'dan büyükse, bu durum genellikle ek ve çok hafif negatif basınç darbeleriyle iyileştirilebilir. Tüm hücre modu elde edildikten sonra, kızılötesi ışığı kapatın ve mikroskobu siyah bir bezle örtün. Hücrenin beş dakika boyunca karanlığa adapte olmasını sağlayın.

Beş dakika sonra, preparat kayıt için hazır hale gelir. Akım klempi modunda, tam alan beyaz ışık stimülasyonunu açın ve ganglion hücresinin yanıtını kaydedin. Ganglion hücresine birden fazla kez stimülasyon uygulanacaksa, stimülasyonlar arasında retinanın gerektiği kadar karanlığa adapte olmasına izin verilmelidir.

Kayıt sonrası ganglion hücresi yanıt özelliklerini değerlendirmek amacıyla, ışık uyaranı bu noktada desenli veya kromatik uyaranları içerecek şekilde değiştirilebilir; hücre içi solüsyondaki floresan izleyici, epi floresan ve DIC kızılötesi optikler arasında geçiş yapılarak dendritlere yayılmış olacaktır. İzleyici, 594 nanometrede epi floresan altında görselleştirilebilir ve ganglion hücresinin "açık", "kapalı" veya "tabakalı" (stratified) olup olmadığını belirlemek için dendritler incelenebilir. Hücre içi solüsyona eklenen nörobiyotin ganglion hücresine yayılmıştır, bu nedenle bir sonraki adım retinayı immünohistokimya için hazırlamaktır.

Hücre membranındaki bozulmayı en aza indirmek için pipeti nazikçe geri çekin. Her preparasyon için yalnızca bir retinal ganglion hücresini kaydedip doldurursanız, kaydedilen ganglion hücresi ile detaylı morfolojisi arasında spesifik korelasyonlar kurabileceğinizi unutmayın. Ardından, retinayı Paraform aldehit çözeltisine yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyerek fiksasyon işlemini tamamlayın.

Fikse edilmiş retinayı, iki veya daha fazla saat boyunca PBS çözeltisini en az altı kez değiştirerek PBS ile durulayın. Durulama işleminden sonra retinayı bloklama çözeltisi içeren bir plakaya aktarın, plakayı bir çalkalayıcıya yerleştirin ve iki saat boyunca bekletin. Oda sıcaklığında, bloklama çözeltisini strep kanıt çözeltisi ile değiştirin, retinayı tekrar çalkalayıcıya yerleştirin ve 4 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.

İki gün sonra, retinayı monte etmek için her biri 20 dakika süren altı kez PBS ile durulayın. Retinayı, vector shield kullanarak bir lam üzerine ganglion hücre tabakası üste gelecek şekilde yerleştirin. Montaj ortamını bir lamellen ile kapatın ve oje ile mühürleyin; etiketlenmiş ganglion hücreleri artık bir konfokal mikroskop altında incelenebilir.

Bu şekil, solda 40 kat büyütmede epi floresan aydınlatma altında ve sağda DIC aydınlatma altında görüntülenen GFP pozitif retinal ganglion hücrelerini göstermektedir. Retina sağlıklıysa ve diseksiyon başarılı olduysa, yüksek büyütmedeki DIC altında tekil ganglion hücreleri görünür. Sağlıksız retinalarda büyük granüllü çekirdekler bulunur ve bunlar atılmalıdır.

Bu şekil, katmanlaşmış intrinsik olarak fotosensitif retinal ganglion hücresi M2 için tipik olan ışık yanıt türünü göstermektedir. Belirli bir preparatta genetik olarak işaretlenmiş retinal ganglion hücresinin türüne bağlı olarak, yanıt özellikleri farklılık gösterecektir. Eğer belirli bir ganglion hücresinin sinaptik yanıtı sağlamsa, hücre ışık başlangıcında veya bitişinde aksiyon potansiyelleriyle yanıt vermelidir.

İçsel olarak foto-hassas bir ganglion hücresinde sürekli bir depolarizasyon durumunda, nörobiyotin ile doldurulmuş bir ganglion hücresinin bu şekli, tipik bir M1 off katmanlaşan, içsel olarak foto-hassas retinal ganglion hücresinin morfolojisini göstermektedir. Tüm hücre kaydının ardından yapılan immünohistokimya, dendritik morfoloji ile retinal ganglion hücresinin elektrofizyolojik yanıtı arasında bir korelasyon kurulmasına olanak tanır. Bu prosedürü uygularken, sinaptik yanıtları korumak için retinal kuyucuğu oksijenlendirmeyi ve dokuyu hızla perfüze etmeyi hatırlamak önemlidir.

Bu gösterimi izlediğiniz için teşekkür ederiz.