Yüksek zenginleştirilmiş Nöronal Kültürlerin Üretimi için Kortikal Doku Blokları, Kriyoprezervasyon

Merhaba, benim adım Alan ve California Irvine Üniversitesi Nörobiyoloji ve Davranış Bölümü'nde Dr.Horney Lu'nun laboratuvarıyım. Ve ben Bob. Bugün, Dr.Haro size yüksek kaliteli primer nöronal kültürlerin müteakip dejenerasyonu için kortikal doku bloklarının rutin kriyo koruması için hızlı, verimli ve güvenilir bir protokol gösterecek.

Öyleyse başlayalım. Temizlenmiş ve doğranmış doku, %10'luk bir TMSO içeren kriyo şişelerine yüklenir. Donma ortamı.

Kriyo şişeleri bir dondurma kabına yüklenir ve en az dört saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirilir. Dondurulmuş kriyo şişeleri daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojene yerleştirilir. Kültürleme için AC kriyo şişesi ılık su banyosunda eritilir ve kalan DMSO'yu çıkarmak için ılık HBSS ile durulanır.

Ayrışma için deneme ns ile birlikte taze HBSS eklenir, ardından %10 EBS'li DMM eklenir. Ayrışma enzimatik aktivitesini durdurmak için hücreler döndürülür ve pelet taze DMM artı %10 EBS içinde yeniden süspanse edilir ve önceden kaplanmış polilisin kapları üzerine kaplanır. 24 saat sonra, DMM takviye edilmiş bir nöro bazal ortama dönüştü ve 10 gün boyunca büyüdü.

Bu protokol, kullanmadan önce kortikal dokuyu kesmek için çelik bir tıraş bıçağı kullanır. Tıraş makinesi en az iki saat boyunca% 70 etanol içinde sterilize edilmelidir. Bir x Hank'in tamponlu tuz çözeltisi HBSS, 10 x stok çözeltisinin sterilize edilmiş suda seyreltilmesiyle oluşturulur, bir X-H-B-S-S daha sonra ya buz üzerinde ya da doku işlenene kadar dört santigrat derecede tutulur.

Dimetil sülf oksit veya DMSO, dondurma ortamında kriyo korumalı bir kriyo olarak kullanılır. Bu protokol, bir X-H-B-S-S-S-D-M-S-O'da% 10'luk bir hacim ve hacim seyreltmesi kullanır, dört santigrat derecede saklamadan önce tamamen karıştırılmalıdır. Nalgene ve dondurma kabı, numuneler için donma oranını kontrol etmek için kullanılır.

Dondurma kabı, önceden etiketlenmiş 2,5 mililitrelik kriyo şişeleri ile doldurulur. Birden fazla kapınız varsa, dondurma kaplarını kendileri etiketlemek ve safra üzerindeki ilgili kabı not etmek de iyi bir fikirdir. Daha önce soğutulmuş %10 DMSO, dondurma ortamı ve dondurma kabı steril bir biyolojik güvenlik kabinine getirilir.

Burada, kriyo şişelerinin her birine yavaşça bir mililitre dondurma ortamı eklenir Kapakların sağlam olduğundan emin olduktan sonra, doku işlemeden hemen önce en az iki saat boyunca dondurma kabını şişelerle birlikte dört santigrat dereceye yerleştirin. Önceden sterilize edilmiş tıraş bıçağının iyice durulanması gerekir. Üç, üç dakikalık yıkamalar.

Kalan etanolü uzaklaştırmak için sterilize su kullanmak yeterli olmalıdır. Tıraş makinesi uzun süre suya daldırılma ve steril sudan oksidasyona eğilimli olduğundan bu yıkama prosedürü hızlı olmalıdır. Temizlemeden önce, doku bir buz torbası üzerine yerleştirilmelidir.

Serbest yüzen kalıntıları temizlemek için soğuk bir X-H-B-S-S ile hafifçe durulayın. Sterilize iğneler, kalan zarların ve kan damarlarının doku parçalarını temizlemek için kullanılır. Temizlik yapılırken dokunun yapısal bütünlüğünün korunmasına özen gösterilmelidir.

Bu artacağı için, temiz dokuyu doğramanın etkinliği ham dokudan gözle görülür şekilde farklı olacaktır ve zarların veya kan damarlarının çoğunun çıkarılması gerekir. Bir mendil temizlendikten ve durulandıktan sonra doğrama işlemi başlayabilir. Dokuyu temiz bir şekilde kesmek ve yaklaşık bir milimetre küp büyüklüğünde bloklar oluşturmak önemlidir.

Çok büyük olan bloklar, çözülme sırasında daha düşük bir hücre verimi sağlar. Bununla birlikte, daha küçük blokların aşırı işlenmesinden de kaçınılmalıdır. Kıyılmış doku, bir otomatik pipet ve biraz soğuk bir X-H-B-S-S kullanılarak toplanabilir.

Toplanan tüm dokuyu geri kazanmak için kabı HBSS ile duruladığınızdan emin olun. Doku daha sonra büyük bir hacimde bir X-H-B-S-S'ye eklenir ve gevşek bir şekilde paketlenmiş bir pelet oluşturarak dibe düşmesine izin verilir. Bu, doku HBSS'ye yerleşirken mevcut olabilecek kalan kalıntıları temizler, dokuyu ayırmadan önce önceden soğutulmuş dondurma kabını ve kriyo şişelerini alır.

Doku doldurma işlemini hızlandırmak için tüm şişelerin kapağını açtığınızdan emin olun. Oda sıcaklığında DMSO'ya maruz kalma 10 dakikadan fazla olmamalıdır. Tüm doku kullanılana kadar her seferinde bir dondurma kabı ile çalışmak iyi bir fikirdir.

Gevşek bir dokunun üst kısmını aspire etmeye başlayın, mısırı rahatsız etmeden pelete mümkün olduğunca yakın bir yerde toplayın. Ardından 200 mikrolitre genişliğinde bir delik ucunu bir pipete yerleştirin. Doku bloğu peletinin dibine giden blokların yapısını tehlikeye atacağı için daha küçük bir uç deliği kullanmayın.

Yavaş yavaş 200 mikrolitre doku toplayın. Bu dokuyu bir kriyo şişesine ekleyin ve tüm şişeler dolana kadar bir sonrakine geçin. 10 dakika kuralı gerekebilir.

Dondurma kabını, en az dört saat veya zaman sınırlıysa gece boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuda kriyo şişelerine hızlı bir şekilde yerleştirin. Yeterli süre sonra, dondurma kabını dondurucudan çıkarın ve kriyo şişelerini mümkün olan en kısa sürede bir kriyo kutusuna yerleştirin. Kriyo kutusunu uzun süreli saklama için bir sıvı nitrojen kutusu rafına yerleştirin.

Kriyo kutularını sınırlayarak sıvı nitrojenden mümkün olan en kısa sürede bir kriyo aşağılığını çıkarın Oda sıcaklığına maruz kalmak, numuneyi 37 santigrat derecelik bir su banyosuna daldırarak hızla eritin. Kapağı her zaman suyun üzerinde tutun. Sık sık kontrol edin ve küçük bir buz P gözlenene kadar çözülmeye devam edin.

Güvenlik kabinine getirmeden önce, kriyo aşağılığı %70 etanol ile sterilize edin. Kriyo aşağılığın duvarlarında doku kalırsa, çözülme dokusunu büyük miktarda ılık bir X-H-B-S-S'ye eklemeye devam edin. HBSS ile nazikçe toplanır.

Bir kere tüm dokular toplandı. Tüpü üç ila dört kez ters çevirin ve dokunun dibe çökmesine izin verin. Bu adım, DMSO'nun yeterli seyreltilmesini sağlar.

Doku yerleştikten sonra, mümkün olduğu kadar çok süper natini aspire edin. Sonra buna 10 mililitre ılık taze bir X-H-B-S-S ekleyin. 300 mikrolitre% 0.25 tripsin ve 50 mikrolitre DNA ekleyin.

Dokuyu hafif bir çalkalama ile ayırmaya devam edin, doku ayrıştıktan sonra bulanık bir hücre süspansiyonu oluşturun. Beş dakika boyunca 1200 G'de ılık DM a artı %10 zenginleştirilmiş sığır serumu EPS santrifüj hücre süspansiyonları ekleyerek enzimatik aktiviteyi durdurun. Hücre peletini taze DMEM artı %10 EBS'de yeniden süspanse edin ve polilisin kaplı plakalara plakalayın.

Hücrelerin 30 dakika boyunca bulaşıklara yapışmasına izin verin. Ardından medyayı yeni DM artı %10 EBS ile değiştirin. 24 saat sonra, DM içeren besiyerini N iki ve B 27 ile takviye edilmiş nöro bazal besiyeri ile değiştirin ve 10 gün boyunca büyütün.

Kortikal doku bloklarının rutin ağlama koruması ile geniş, verimli ve güvenilir bir protokolü detaylandırdık. Çok iyi şanslar.