Bir Embriyonik Fare Modelinde In Utero Nanoenjeksiyon Yoluyla Nöral Plaka Hücre Manipülasyonu

Anestezi uygulanmış bir hamile fareyi, ön nörülasyon embriyoları içeren açıkta kalan uterusu ile sabitleyin. Bu aşamada, nöral plak açıktır ve doğrudan amniyotik sıvıya maruz kalır.

Seçilen embriyoları stabilize etmek için elastik bir zara sahip bir petri kabına yerleştirin. Embriyoları sabitleyin ve hidrasyon için tuzlu su uygulayın.

Ultrason probunu embriyo üzerine hizalayın ve optimum enjeksiyon hacmini hesaplamak için amniyotik boşluk çapını ölçün.

Yüksek titreli lentiviral çözelti içeren bir nano enjeksiyon iğnesini hedef embriyonun üzerine dike yakın bir açıyla yerleştirin.

Amniyotik boşluğa hassas küçük bir hacim enjekte edin, iğneyi yavaşça geri çekin ve ultrason probunu çıkarın.

Embriyoları yavaşça farenin içine geri itin.

Enjekte edilen lentivirüs, nöral plaka hücreleri ile birleşerek, DNA'ya ters transkripsiyona uğrayan ve konakçı genomuna entegre olan genetik materyalini serbest bırakır.

Bu, nöral plaka hücrelerinde stabil gen manipülasyonunu mümkün kılar ve potansiyel terapötik uygulamaları destekler.

Forseps kullanarak, dokuyu embriyolar arasında tutun ve her iki uterus boynuzunu karından dikkatlice çıkarın. Yumurtalıktan rahim ağzına veya rahim ağzından yumurtalığa kadar her iki taraftaki embriyoları sayın ve numaralandırın.

Daha sonra, nemli bir pamuklu çubukla, enjekte edilecek ilk üçü hariç tüm embriyoları yavaşça karın boşluğuna geri itin. Daha sonra, ticari olarak temin edilebilen modifiye edilmiş bir Petri kabının yuvarlak merkezi açıklığına yapıştırılmış elastik bir zar üzerine bir damla PBS yerleştirin ve hemen embriyoların üzerinde tutun. Kapalı forsepsleri elastik insizyona yerleştirin, ardından elastik insizyonu açmak için forsepsleri serbest bırakın ve sıvıyı embriyoların üzerine bırakın.

Forseps kullanarak, uterusun üç embriyoya karşılık gelen bölümünü elastik içinden çekin ve Petri kabını farenin karnına nazikçe tünetin. Dört kil ayağı kullanarak, fare üzerindeki baskıyı azaltmak için Petri kabını karnın üzerine sabitleyin ve sabitleyin ve ayrıca farenin solunumuna ve kalp atışına karşı görüntüleme hassasiyetini azaltın. Daha sonra, forseps ve nemli bir pamuklu çubuk kullanarak, elastikin farenin derisi etrafında sızdırmaz hale geldiğinden emin olmak için uterusu ve elastiki ayarlayın ve PBS sızıntısını önleyin.

Daha sonra, uterusu sabitlemek için, modelleme kil silindirini embriyoların veya uterusun sağına doğru bastırın ve embriyolar ve uterus tamamen PBS ile kaplanana kadar Petri kabına PBS ekleyin. Enjeksiyonların kaydedilmesini kolaylaştırmak için, ultrason probunu PBS'ye daldırın ve fareyi veya ameliyat masasını, ilk embriyo ultrason probu ile hizalanacak şekilde ayarlayın. Her üç embriyoyu da tarayın ve amniyotik boşlukları inceleyin.

Ardından, ultrason makinesini kullanarak, uygun enjeksiyon hacmini belirlemek için amniyotik boşluğun çapını ölçün. Enjeksiyon kontrol cihazını kullanarak, saniyede 23 nanolitre enjeksiyon hızı ile belirlenen enjeksiyon hacimlerini ve enjeksiyon hızını yavaşlamaya ayarlayın. İğneyi PBS'ye indirdikten sonra, ray sistemi üzerindeki ana tekerlekleri kullanarak, sıvı iğne ucuna ulaşana kadar nanoenjektör kontrol cihazındaki Boş'a basın.

Ardından, iğneyi PBS'den kaldırın ve yaklaşık istenen hacimde bir damla boşaltıldığını doğrulamak için Enjekte Et'e basın. İğneyi tekrar PBS'ye indirin ve iğneyi ultrason probu ve embriyo ile hizalamak için nanoenjektörü mikromanipülatör üzerindeki Y-düzlem tekerleği ile hareket ettirin. Rahim duvarına göre dike yakın bir enjeksiyon açısı sağlamak için enjeksiyon açısı tekerleği ile iğne açısını ayarlayın.

Daha sonra, mikromanipülatör üzerindeki enjeksiyon tekerleğini kullanarak, iğneyi tek bir hareketle amniyotik boşluğa sokun. İğne ucu ultrason görüntüsünden kaybolursa, iğneyi tekrar odaklamak için probu ileri veya geri hareket ettirin. Ardından, Inject'e uygun sayıda basarak istenen hacmi enjekte edin.

Gerekli hacim enjekte edildikten sonra, iğneyi tek bir hafif hareketle geri çekmeden önce 5 ila 10 saniye bekleyin.

Ardından, mikromanipülatörü kullanarak ultrason probunu ve iğneyi PBS'den kaldırın, hasar ve yaralanmayı önlemek için iğneyi operatörden uzaklaştırın.

Forseps kullanarak, birinci ve ikinci embriyoları elastikten hafifçe iterek karın içine geri yerleştirin.

Optimal amniyotik boşluklara sahip tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, embriyoları ve uterusu nazikçe farenin karnına geri itin.