Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerinde mRNA nükleer ihracatının kinetiğini ölçmektir. Bu, ilk olarak mRNA veya DNA'nın memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mikro enjekte edilmesiyle elde edilir. Mikroenjeksiyonu takiben, numuneler çeşitli inkübasyon dönemlerinden sonra tespit edilir.

mRNA daha sonra floresan in situ hibridizasyon veya balık ile boyanır. Prosedürün son adımı, hücreleri görüntülemek ve sitoplazma ve çekirdekteki floresan miktarını ölçmektir. Sonuç olarak, mRNA dışa aktarma hızı, mikroenjeksiyon ve floresan mikroskobunun bir kombinasyonu ile ölçülebilir.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nde Alex Palazzo'nun laboratuvarından SRG AV. Ben Stefan Toski, aynı zamanda Palazzo Lab'danım. Ben Palazzo laboratuvarından Amy ve Palazzo laboratuvarından Khi Maha David.

Bugün size mRNA'yı memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeğine mikroenjeksiyon yoluyla sokmak için bir prosedür göstereceğiz. Ayrıca mRNA'nın C iki hibridizasyonunda floresan ile nasıl boyanacağını da göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürleri, memeli hücrelerinde mRNA nükleer ihracatının kinetiğini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Mikroenjeksiyon işleminden önce, daha önce enjeksiyon tamponunda mililitre başına 50 ila 200 mikrogram arasında plazma DNA'sı hazırlandı. Daha sonra Oregon Green'de, enjekte edilen hücrelerin tanımlanmasını sağlamak için karışıma 70 kilodalton dekstran konjuge 4 88 veya OG.

OG konjuge dekstran, sıvının ne kadarının çekirdeğe enjekte edildiğini ve sitoplazma santrifüjüne ne kadarının sızdığını belirlemeye yardımcı olacaktır. 13.000 G ve dört santigrat derecedeki numuneler, iğne ucunu potansiyel olarak tıkayabilecek herhangi bir partikül maddeyi peletlemek için en az 20 dakika boyunca tutulur. Yazılı protokol maliyetinde açıklanan kriterlere göre mikro enjekte edilecek memeli hücre hattını seçin.

Bu gösteri tohumu için yedi hücre kullanılır. Asitle yıkanmış örtü üzerindeki hücreler, mikroenjeksiyondan en az 24 saat önce 30 milimetrelik Petri kaplarına kayar. İdeal olarak, enjekte edilen hücrelerin kolay tanımlanmasını sağlamak için hücre tek tabakası enjeksiyon sırasında kabaca %70 ila %90 oranında birleşik olmalıdır, hücre tek tabakası enjeksiyondan önce 200 mikrolitrelik bir plastik pipet ucu kullanılarak sarılır.

Kapak kızağı üzerine çapraz bir yara aşındırın ve hücreleri enjeksiyondan en az 15 dakika önce doku kültürü inkübatöründe iyileşmeye bırakın. Mikroenjeksiyon için, mikroenjeksiyon işleminde kesintiye uğrayabilecek titreşimleri en aza indirmek için bir hava tablası üzerinde izole edilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Bir einor jel yükleyici ucu kullanarak, peleti bozmamak için santrifüj numunesinin üstünden yaklaşık bir mikrolitre çıkarın.

Pipetin ucunu önceden hazırlanmış bir mikroenjeksiyon iğnesinin arka ucuna yerleştirin ve sıvıyı çıkarın. Sıvı, kılcal hareket ile iğne ucuna çekilecektir. Uca yakın bir menisküs beş ila 30 saniye içinde görünür olmalıdır.

Sıvı dolu iğneyi çubuğa yerleştirin ve mikro manipülatöre sıkıştırın. 45 derecelik bir açıyla, 10 x objektifi kullanarak iğneyi görselleştirin ve görüntüleme alanının merkezinde, odak düzlemine yakın bir yere yerleştirin. Kaba mikro manipülatör düğmeleri kullanılarak, çubuk bir tüp ile bir cam şırıngaya bağlanır, bu da sıvıyı iğne ucundan çıkarmak için gereken basıncı oluşturmak için kullanılır.

Sabit bir basıncı korumak için, şırınga bir boru kelepçesine monte edilir. İki lastik tıpa ve iki metal kelepçe kullanarak, sonraki adımlarda hasar görmesini önlemek için iğneyi birkaç milimetre kaldırın ve ardından mikroskobu geri itin. Sütun, şırınga pistonuna basarak basıncı arttırın.

0,5 ila iki santimetreküp. Yaralı bir tek tabaka ile bir kapak fişi içeren bir Petri kabı yerleştirin. Görüntüleme sahnesinde mikroskobu geri çekin.

Sütunu dik konuma getirin ve kondansatörün sıvıya girmesi için iğne içinde hizalanmasına neden olur. Bu, iğnenin kapak kızağı üzerinde kırılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. 10 x objektifi kullanarak, çapraz yaranın merkezini belirleyin ve iğneyi enjekte edilecek hücrelerin üzerine yerleştirin.

40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın. Ardından joystick'teki ince ayar düğmelerini kullanarak iğneyi indirin ve ortalayın. Çekirdeğe temas etmek için iğneyi indirerek yara çaprazının bir köşesinde enjeksiyona başlayın.

Enjekte edildikten sonra, bir hücre faz parlaklığında kayda değer bir değişikliğe sahiptir. Yara haçının bir kenarı boyunca devam edin. Görselleştirme sırasında enjekte edilen hücrelerin kolay tanımlanması için, enjeksiyon basıncının her iğne için uygun şekilde ayarlanması çok önemlidir.

Basınç, plazma ve nükleer zarları delecek kadar yüksek olmalı, ancak hücreleri öldürecek kadar yüksek olmamalıdır. Mikro, hücreleri yara kenarı boyunca sabit bir süre boyunca enjekte eder. Uygulamada, bu aralıkta birkaç yüz hücre enjekte edilebilir.

Plazma DNA'sı enjekte ediliyorsa, mikro enjekte edilen hücreleri fiksasyondan önce 20 dakika boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin, ardından transkripsiyonu sonlandırın. Hücreleri mililitre alfa başına bir mikrogram ile muamele ederek, büyüme ortamında çözünmüş bir manto. Bu konsantrasyon, mikro enjekte edilen plazmitlerden transkripsiyonu etkili bir şekilde inhibe eder.

Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin yeni sentezlenen mRNA'yı dışa aktarmasına izin verin. Birden fazla kapak fişi enjekte etmek için tek bir iğne yeniden kullanılabilir. Mikro enjekte edilen DNA veya RNA tipi değiştiğinde iğnenin değiştirilmesi gerekmesine rağmen.

Ayrıca, iğne çubuktan çıkarıldıktan sonra, mRNA nükleer ihracat kinetiğinin doğru bir ölçümünü elde etmek için atılmalıdır. Ayrı numuneler sıfır dakika, 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakika olarak sabitlenmelidir. Uygun zamanda alfa manin tedavisinden sonra, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri iki mililitre PBS çözeltisinde iki kez yıkayın.

Kapak kızaklarını sıvıya batırılmadıkları süreyi en aza indirerek nemli tutmak önemlidir. PBS'ye iki mililitre% 4 Aldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin, hücreleri oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. Sabit numuneleri iki kez daha yıkadıktan sonra, hücreleri PBS'de iki mililitre% 0.1 Triton X 100 ile geçirgen hale getirin, hücreleri tekrar oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin.

Son olarak, numuneleri hibridizasyona hazırlamak için numuneleri iki kez daha yıkayın. Hücreleri,% 25 ila 60 oranında bir orta form içeren bir XSSC çözeltisinden oluşan bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Daha sonra, 150 milimetrelik bir Petri kabının altını suyla kaplayarak ve üstüne bir parça paraform yüzdürerek boyama odasını hibridizasyon için hazırlayın.

Çanağı ters çevirerek suyu çıkarın, böylece paraformun tabağın dibine yapışmasına izin verin. Lekelenecek her bir kapak astarı için hava kabarcıklarını manuel olarak çıkarın. 100 mikrolitrelik hibridizasyon solüsyonunu paraform üzerine pipetleyin.

Forseps yardımıyla kullanılan belirli balık profesyoneli için form miktarının optimize edilmesi gerektiğini unutmayın. 30 milimetrelik Petri kabından sabit hücrelerle birlikte bir kapak fişini çıkarın. Watman filtre kağıdı kullanarak, kapak kaymasının arka tarafını kurutun ve hücreleri kurutmadan ön taraftaki fazla tamponu fitilleyin.

Ardından kapak fişini yüzü aşağı bakacak şekilde balık solüsyonunun üzerine yerleştirin. Her kapak fişi için bu işlemi tekrarlayın. Boyama odalarının kapağını tekrar taktıktan sonra, numuneleri 37 santigrat derecede beş ila 18 saat inkübe edin.

Her bir kapak için boyama haznesinin hazırlandığı şekilde birkaç yıkama haznesi hazırlayın: yıkama haznesinin paraformuna bir mililitre yıkama tamponu pipeti takın. İnkübasyondan sonra, bir mililitre yıkama tamponu pipetleyerek kapak fişlerini boyama haznesinden çıkarın. Kapak kaymasının yanında, sıvı, kılcal hareket ile her numunenin altına çekilmelidir.

Daha sonra kapak fişlerini forseps ile çıkarın ve her birini bir damla yıkama tamponu üzerine koyun, oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Her bir kapak fişini iki kez daha yıkayın, her kapak için toplam üç yıkama için, daha önce yıkanmış bir slayta 10 ila 30 mikrolitre montaj solüsyonu pipetleyin. Her slayt, forseps ve watman filtre kağıdı kullanarak iki kapak fişini barındırabilir.

Kapak kızaklarının arkasını kurutun ve numuneleri kurutmadan kapak kızağının ön tarafındaki fazla sıvıyı fitilleyin. Her bir kapak kızağını yüzü aşağı bakacak şekilde bir damla montaj solüsyonunun üzerine yerleştirin. Monte edilen numuneler dört santigrat derecede saklanabilir.

Burada, alfa mantinin enjekte edilen plazma DNA'sının transkripsiyonu üzerindeki etkileri, değişen konsantrasyonlarda alfa mantin ile ön işleme tabi tutulan NIH üç T üç fibroblast hücresini göstermiştir. Hastalara TFL'nin delta i, plazmid DNA ve OG konjuge 70 kilo ve dekstran enjekte edildi. Her satır, OG 70 kilodalton dekstran ve Uts delta I mRNA için görüntülenen tek bir görüş alanına karşılık gelir.

İlacın yüksek konsantrasyonlarının T UTS delta I transkript üretimini tamamen inhibe ettiği açıktır, ancak bu daha düşük konsantrasyonlarda gözlenmemiştir. Gösterilen. İşte mRNA nükleer ihracat maliyetinin bir zaman seyri. Yedi hücreye T UTS delta i plazma DNA'sı ve OG konjuge 70 kilodalton dekstran enjekte edildi.

Enjekte edildikten 30 dakika sonra hücreler alfa mantin ile muamele edildi ve 37 santigrat derecede sıfır dakika, 60 dakika ve 120 dakika inkübe edildi. Hücreler daha sonra sabitlendi ve T UTS delta I mRNA'ya karşı bir prob ile boyandı. Ve ER işaretleyici tuzağı alfa'ya karşı antikorlarla, her satır tek bir hücre alanına karşılık gelir.

mRNA dışa aktarımının nasıl ölçüleceği hakkında bilgi için lütfen buradaki çevrimiçi metne bakın. 120 dakikalık zaman noktası havaya uçuruldu Acil serviste TFS delta I mRNA'nın kolokalizasyonunu göstermek için, yeşil renkte T UTS delta I mRNA'nın bir kaplaması ve kırmızı renkte tuzak alfa gösterilmiştir. mRNA'nın proteinlerle nasıl boyanacağına dair bilgiler çevrimiçi metinde bulunabilir.

Az önce size mRNA'nın nükleer ihracat kinetiğini mikroenjeksiyon ile nasıl ölçeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, başarılı bir mikroenjeksiyonun uygun hazırlık gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. DNA ve RNA, numune hazırlama, iğne çekme, optik ekipmanların hizalanması ve mikroenjeksiyonda sorun giderme gibi temel adımlar yazılı protokolümüzde açıklanmıştır.

Mikro enjekte edilen mRNA'yı görüntülerken ve analiz ederken, miktar tayininin enjekte edilen sıvının %90'ından fazlasını çekirdeğe alan hücrelerle sınırlı olması önemlidir. Başarılı bir nükleer enjeksiyon, çekirdek ve sitoplazmadaki organ yeşil dekstranın dağılımını görselleştirerek değerlendirilebilir. Balık probları tasarlama hakkında daha fazla bilgi ve çekirdekteki sitoplazmadaki mRNA dağılımını analiz etmek için görüntü analiz yazılımını kullanmak için lütfen çevrimiçi protokolümüze bakın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.