Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerdeki mRNA nükleer dışa aktarım kinetiğini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mRNA veya DNA mikroenjeksiyonu yapılarak gerçekleştirilir. Mikroenjeksiyonun ardından örnekler, çeşitli inkübasyon sürelerinden sonra fikse edilir.

Ardından mRNA, floresan yerinde hibritleme (FISH) ile boyanır. Prosedürün son adımı, hücrelerin görüntülenmesi ve sitoplazma ile çekirdekteki floresans miktarının nicelendirilmesidir. Nihayetinde, mRNA eksport hızı, mikroenjeksiyon ve floresan mikroskopisinin kombinasyonu ile ölçülebilir.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Alex Palazzo laboratuvarından SRG AV. Ben de Palazzo Lab'dan Stefan Toski. Ben Palazzo Lab'dan Amy ve ben de Palazzo Lab'dan Khi Maha David.

Bugün sizlere, mikroenjeksiyon yoluyla memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mRNA aktarma prosedürünü göstereceğiz. Ayrıca, mRNA'nın floresan yerinde (in situ) hibridizasyon ile nasıl boyanacağını uygulamalı olarak göstereceğiz. Laboratuvarımızda, memeli hücrelerdeki mRNA nükleer eksport kinetiğini incelemek için bu prosedürleri kullanmaktayız.

Haydi başlayalım. Mikroenjeksiyon öncesinde, önceden hazırlanmış plazma DNA'sını enjeksiyon tamponu içerisinde mililitre başına 50 ile 200 mikrogram arasına getirin. Ardından, enjekte edilen hücrelerin tanımlanmasını sağlamak için karışıma 70 kilodalton dekstrana konjuge edilmiş Oregon Green 488 veya OG ekleyin.

OG konjuge dekstran, sıvının ne kadarının çekirdeğe enjekte edildiğini ve ne kadarının sitoplazmaya sızdığını belirlemeye yardımcı olacaktır. İğne ucunu potansiyel olarak tıkayabilecek partiküler maddeleri çöktürmek için örnekleri 13.000 G ve dört derece santigrat sıcaklıkta en az 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Mikroenjeksiyon yapılacak memeli hücre hattını, yazılı protokol maliyetinde açıklanan kriterlere göre seçin.

Bu gösterim tohumu için yedi hücre kullanılır. Hücreler, mikroenjeksiyondan en az 24 saat önce 30 milimetrelik Petri kaplarındaki asitle yıkanmış lameller üzerine yerleştirilir. İdeal olarak, enjekte edilen hücrelerin kolayca tanımlanabilmesi için enjeksiyon sırasında hücre monokatmanı yaklaşık %70 ila %90 konfluens düzeyinde olmalıdır; enjeksiyondan önce hücre monokatmanı, 200 mikrolitrelik plastik pipet ucu kullanılarak yaralanır.

Lamel üzerine artı şeklinde bir yara açın ve hücrelerin enjeksiyondan önce doku kültürü inkübatöründe en az 15 dakika boyunca toparlanmasını bekleyin. Mikroenjeksiyon için, mikroenjeksiyon işlemini bozabilecek titreşimleri en aza indirmek amacıyla hava tablası üzerinde izole edilmiş ters bir mikroskop kullanın. Peletin bozulmasını önlemek için, bir jel yükleme ucu kullanarak santrifüj örneğinin üst kısmından yaklaşık bir mikrolitre hacim kaldırın.

Pipet ucunu önceden hazırlanmış bir mikroenjeksiyon iğnesinin arka kısmına yerleştirin ve sıvıyı boşaltın. Sıvı, kılcal hareketle iğne ucuna çekilecektir. Beş ila 30 saniye içinde uç kısmına yakın bir menisküs görülmelidir.

Sıvı dolu iğneyi değneğin içine yerleştirin ve mikro manipülatöre sabitleyin. 10 x objektif kullanarak iğneyi 45 derecelik bir açıyla görüntüleyin ve odak düzleminin yakınındaki görüş alanının merkezine konumlandırın. Kaba mikro manipülatör düğmeleri kullanılırken, değnek bir tüp aracılığıyla, sıvıyı iğne ucundan püskürtmek için gereken basıncı oluşturmak amacıyla kullanılan bir cam şırıngaya bağlanmıştır.

Sabit bir basınç sağlamak için şırınga bir boru kelepçesine monte edilir. İğnenin sonraki adımlarda zarar görmesini önlemek için iki kauçuk tıpa ve iki metal kelepçe kullanarak iğneyi birkaç milimetre yukarı kaldırın ve ardından mikroskobu geri itin. Şırınga pistonunu aşağı iterek basıncı artırın.

0,5 ile iki santimetreküp arası. Yaralanmış bir monolayer içeren lamel bulunan bir Petri kutusunu yerleştirin. Görüntüleme tablasında mikroskobu geri çekin.

Kondanserin, iğnenin sıvıya girmesini sağlayacak şekilde hizalanması için sütunu dik konuma getirin. İğnenin lamel üzerinde kırılmasını önlemek için bu işlem dikkatlice yapılmalıdır. 10 x objektif kullanarak, çapraz yaranın merkezini belirleyin ve iğneyi enjekte edilecek hücrelerin üzerine konumlandırın.

40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın. Ardından, joystick üzerindeki ince ayar düğmelerini kullanarak iğneyi indirin ve merkezleyin. İğneyi çekirdekle temas edecek şekilde indirerek, yara artı işaretinin bir köşesinden enjeksiyona başlayın.

Enjeksiyon yapıldıktan sonra, hücrenin faz parlaklığında belirgin bir değişiklik olur. Yara haçının bir kenarı boyunca devam edin. Görüntüleme sırasında enjekte edilen hücrelerin kolayca tanımlanabilmesi için, enjeksiyon basıncının her iğne için uygun şekilde ayarlanması kritik önem taşır.

Basınç, plazma ve nükleer membranları delip geçecek kadar yüksek olmalı, ancak hücreleri öldürecek kadar yüksek olmamalıdır. Yaralı kenar boyunca belirli bir süre boyunca hücrelere mikroenjeksiyon yapın. Pratikle, bu süre zarfında birkaç yüz hücreye enjeksiyon yapılabilir.

Plazmid DNA enjekte ediliyorsa, fiksasyon öncesinde mikroenjekte edilen hücreleri 20 dakika boyunca 37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin, ardından transkripsiyonu sonlandırın. Hücreleri, büyüme ortamında çözünmüş 1 µg/mL α-amanitin ile tedavi edin. Bu konsantrasyon, mikroenjekte edilen plazmidlerden transkripsiyonu etkili bir şekilde inhibe eder.

Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve yeni sentezlenen mRNA'nın hücre dışına çıkmasına izin verin. Tek bir iğne, birden fazla lamın enjeksiyonu için tekrar kullanılabilir. Ancak, mikroenjeksiyonla verilen DNA veya RNA türü değiştiğinde iğnenin değiştirilmesi gerekir.

Ayrıca, iğne wand'dan çıkarıldıktan sonra, mRNA nükleer dışa aktarım kinetiğinin doğru ölçümünü elde etmek için atılmalıdır. Ayrı örnekler sıfır dakika, 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120. dakikalarda fikse edilmelidir. Uygun sürede alfa manin uygulamasının ardından, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri iki mililitrelik PBS çözeltisi ile iki kez yıkayın.

Lamellerin sıvı içinde kalmadıkları süreyi en aza indirerek nemli tutulmaları önemlidir. Hücreleri, 2 mL %4'lük PBS içinde Aldehit ekleyerek fikse edin ve hücreleri oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. Fikse edilen numuneleri iki kez daha yıkadıktan sonra, hücreleri 2 mL %0,1'lik PBS içinde Triton X 100 ile permeabilize edin ve hücreleri tekrar oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin.

Son olarak, örnekleri hibridizasyona hazırlamak için iki kez daha yıkayın. Hücreleri, %25 ila 60 formamid içeren bir XSSC solüsyonu yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, 150 milimetrelik bir Petri kabının tabanını suyla kaplayıp üzerine bir parça paraform yüzdürerek hibridizasyon için boyama odasını hazırlayın.

Kabı ters çevirerek suyu uzaklaştırın, böylece paraformun kabın tabanına yapışmasını sağlayın. Boyanacak her bir lamelleki hava kabarcıklarını manuel olarak giderin. Paraformun üzerine 100 µL hibridizasyon çözeltisi damlatın.

Formage miktarının, pens yardımıyla kullanılan ilgili balık probuna göre optimize edilmesi gerektiğini unutmayın. Sabitlenmiş hücrelerin bulunduğu lameli 30 milimetrelik Petri kabından çıkarın. Watman filtre kağıdı kullanarak lamelin arka yüzünü kurulayın ve hücreleri kurutmadan ön yüzdeki fazla tampon çözeltiyi emdirerek alın.

Ardından, lameli yüzeyi aşağı gelecek şekilde balık solüsyonunun üzerine yerleştirin. Bu işlemi her bir lamel için tekrarlayın. Boyama odası kapağını tekrar kapattıktan sonra, örnekleri 37 °C'de beş ila 18 saat boyunca inkübe edin.

Her bir lamla için, boyama odasına benzer şekilde birkaç yıkama odası hazırlayın; yıkama odasındaki parafilmin üzerine bir mililitre yıkama tamponu pipetleyin. İnkübasyonun ardından, bir mililitre yıkama tamponu pipetleyerek lamları boyama odasından çıkarın. Sıvı, kılcal hareketle her bir örneğin altına çekilmelidir.

Ardından lamine camları pensle çıkarın ve her birini oda sıcaklığında beş dakika bekletilmiş bir damla yıkama tamponu üzerine yerleştirin. Her lamine camı iki kez daha yıkayarak toplamda üç yıkama gerçekleştirin; önceden yıkanmış bir lam üzerine DAPI içeren 10 ila 30 µL montaj solüsyonu pipetleyin. Her lam, pens ve Whatman filtre kağıdı kullanılarak iki lamine cama ev sahipliği yapabilir.

Lamellerin arkasını kurulayın ve örnekleri kurutmadan lamellerin ön yüzündeki fazla sıvıyı emdirerek alın. Her bir lamelin ön yüzünü bir damla montaj çözeltisinin üzerine gelecek şekilde yerleştirin. Monte edilmiş örnekler dört derece Celsius sıcaklıkta saklanabilir.

Burada, farklı konsantrasyonlarda alfa mantin ile ön işlem görmüş NIH 3T3 fibroblast hücrelerinde, enjekte edilen plazmid DNA'nın transkripsiyonu üzerindeki alfa mantin etkileri gösterilmiştir. Hücrelere TFL s delta i plazmid DNA ve OG konjuge 70 kilo dalton dekstran enjekte edilmiştir. Her satır; OG 70 kilo dalton dekstran ve T uts delta I mRNA için görüntülenen tek bir görüş alanına karşılık gelmektedir.

İlacın yüksek konsantrasyonlarının T UTS delta I transkript üretimini tamamen inhibe ettiği, ancak düşük konsantrasyonlarda bunun gözlemlenmediği açıktır. Gösterilmiştir. Burada, mRNA nükleer export maliyetinin zaman seyri yer almaktadır. Yedi hücreye T UTS delta i plazma DNA ve OG konjuge 70 kilodalton dekstran enjekte edilmiştir.

Hücreler enjekte edildikten 30 dakika sonra alfa mantin ile işleme tabi tutulmuş ve 37 °C'de 0 dakika, 60 dakika ve 120 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Ardından hücreler fikse edilmiş ve T UTS delta I mRNA'ya karşı bir prob ile ER belirteci trap alfa'ya karşı antikorlarla boyanmıştır; her satır tek bir hücre alanına karşılık gelmektedir.

mRNA ihracatının nasıl nicelleştirileceğine dair bilgi için lütfen buradaki çevrimiçi metne bakın. 120 dakikalık zaman noktası büyütülmüştür. TFS delta I mRNA'sının ER'deki kolokalizasyonunu göstermek için, yeşil renkte T UTS delta I mRNA'sı ve kırmızı renkte trap alpha'nın üst üste bindirilmiş görüntüsü gösterilmektedir. mRNA'nın proteinlerle nasıl eş zamanlı olarak boyanacağına dair bilgiler çevrimiçi metinde bulunabilir.

Mikroenjeksiyon yoluyla mRNA'nın nükleer eksport kinetiğinin nasıl ölçüleceğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, başarılı bir mikroenjeksiyonun uygun hazırlık gerektirdiğini unutmamak önemlidir. DNA ve RNA hazırlığı, numune hazırlama, iğne çekme, optik ekipmanların hizalanması ve mikroenjeksiyon sorun giderme gibi temel adımlar yazılı protokolümüzde açıklanmıştır.

Mikroenjekte edilmiş mRNA'nın görüntülenmesi ve analizinde, kantifikasyonun, enjekte edilen sıvının %90'ından fazlasını çekirdeğe alan hücrelerle sınırlandırılması önemlidir. Başarılı bir çekirdek enjeksiyonu, organ green dekstranın çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımı görselleştirilerek değerlendirilebilir. Balık problarının tasarımı ve mRNA'nın sitoplazma ile çekirdekteki dağılımını analiz etmek için görüntü analiz yazılımının kullanımı hakkında daha fazla bilgi için lütfen çevrimiçi protokolümüze bakınız.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.