Name: Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerde mikroenjeksiyon ve floresan in situ hibridizasyon kullanarak mRNA nükleer ihracat kinetiğini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, sitoplazma ve nükleus arasındaki mRNA hareketinin hassas kantitatif analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, bize çeşitli ekipman kullanımı için izin verdiği için faydalı öneri ve A. Wilde E. Gomes teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (FRN 102.725) Enstitüsü AFP bir hibe ile desteklenmiştir.

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

Mikroenjeksiyon farklı hücresel süreçlerin bir dizi çalışma için kullanılan güçlü bir araçtır. Geleneksel hücre transfeksiyon aksine, mikroenjeksiyon, araştırmacı, çok dar bir zaman dilimi içinde etkili bir şekilde hücresel çekirdek içine nükleik asitlerin tanıtmak sağlar. Sonuç olarak, bir mRNA ihracat mRNA yerelleştirme ve protein sentezi oranlarının belirlenmesinde gibi kinetik analizler gerçekleştirebilirsiniz. Ayrıca, deney zaman dilimi nispeten kısa olduğundan, bir pleiotropik etkileri ödemeden kısa zaman dilimlerine içinde hücreleri toksik bileşikleri açığa çıkarabilir. Dahası, dominant negatif proteinler gibi inhibitör veya uyarıcı bileşikler, nükleik asitler ile eş-enjekte edilebilir. Son olarak, microinjections genellikle hücreleri için toksik ve farklı hücresel fonksiyonları karıştırmayı transfeksiyon reaktifler, gereksinimini ortadan kaldırmak. plazmid DNA enjeksiyonları vs mRNA Nükleik asit enjekte etmek için bir takım hususlar bağlıdır hangi seçim. Plazmid DNA enjeksiyonundan sonra, RNA Polimeraz II mRNA sentezler, aynı zamanda doğmakta olan transkript 12,13 protein faktörleri acemi değil sadece. Bu faktörlerin mRNA işlenmesi, nükleer ihracat ve sitoplazmik lokalizasyon gibi olayları yöneten, plazmid DNA enjeksiyonu transkripsiyon downstream prosesler birleştiğinde nasıl değerlendirmek için kullanılabilir. Transkripsiyon nükleer ihracat 14 birleştiğinde olabilmesine rağmen, biz enjekte mRNA transkripsiyonu mRNA in vivo 6 daha biraz daha hızlı ihraç olduğunu bulduk. Bunun nedenleri şu anda net değil, ancak bu sonucu olarak yeni sentezlenen mRNA RNA Polimeraz II çıkar önerebilir, bu geciktirir nükleer ihracat kompleksleri kadar bağlı olabilir. MRNA enjeksiyonları ile bazı avantajları vardır. İlk olarak, araştırmacı hücrelerin RNA genel metabolizmasını düzenleyen nasıl etkileyebilir, RNA Polimeraz inhibitörleri kullanmak zorunda değildir. İkincisi, RNA enjeksiyondan önce, in vitro olarak değiştirilmiş olabilir. Örneğin, mRNA&#39;ların, bu özellikleri nükleer ihracat 6 nasıl etkilediğini değerlendirmek için çeşitli 5 &#39;şapka analogları veya poli (A) kuyruk uzunlukları ile sentezlenmiş olabilir . Üçüncüsü, enjekte edilir RNA tam miktarı kabaca tahmin edilebilir. Yukarıda belirtilen protokol sonrasında, tipik bir memeli hücre (400,000 850,000 molekülü) 15 transkript toplam sayısı ile kıyaslandığında, nispeten küçük her çekirdek, yaklaşık 20.000 ila 50.000 moleküller enjekte olduğunu tahmin ediyoruz . MRNA enjeksiyonu ile en büyük dezavantajı, mikroenjeksiyon sırasında, sitoplazma içine enjeksiyon sıvısının bazı kaçak kaçınılmaz olduğunu. Sitoplazma içine doğrudan enjekte mRNA (A. Palazzo, basılmamış gözlem) üzerinde uzun süre sabit olduğundan, ekstra bakım hücreleri sayısal seçmek için alınmalıdır. Genellikle enjeksiyon sıvısı&gt;% 90 olarak RG-dekstran dağılımı ile değerlendirildi çekirdeği, alınan hücrelerin analiz eder.

<table><tbody><tr><td>Enjeksiyon tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl ve 10 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Oregon Green 488-70kD Dekstran</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>Enjeksiyon tamponu içindeki 10mg/ml stok, -80&amp;#x00B0;C'de uzun süreler boyunca saklanabilir</td></tr><tr><td>Borosilikat kapiler tüpler</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon iğnelerini doldurmak için jel yükleme pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon şırıngası</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>SSC Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM sodyum sitrat, pH 7.4</td></tr><tr><td>%4 Paraformaldehit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>%37 Paraformaldehit stok çözeltisi PBS ile seyreltilir</td></tr><tr><td>%0.1 Triton X-100 (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>%10 Triton X-100 stok çözeltisi PBS ile seyreltilir</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Vanadil ribozid kompleksi (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filtre kağıdı</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Titreşim kontrol masası</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Brown Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Gresi</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Polimeraz</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100mg/ml dekstran sülfat, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodyum sitrat, 0.5mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA, %60 formamid</td></tr></tbody></table>

mikroenjeksiyon tarafından memeli hücreleri mrna nükleer İhracat kinetik analizi

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Ökaryotlarda mesajcı RNA (mRNA) çekirdeğinde transkripsiyonu ve sitoplazma çeviri makine erişmek için ihraç edilmelidir. MRNA nükleer ihracat Xenopus oositleri 1 ve maya 2 ve Drosophila elde edilen S2 hücre hattı 3 gibi uysal organizmaların genetik yoğun çalışılan olsa da, memeli hücrelerinde az sayıda çalışma yapılmıştır. Ayrıca memeli somatik hücre mRNA ihracat kinetiği sadece dolaylı olarak 4,5 anlaşılmaktadır. Memeli doku kültürü hücrelerinde mRNA nükleer ihracat kinetiği ölçmek için, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir test geliştirdiler. Bu deneyleri, memeli hücrelerinde ekleme bağımlı bir şekilde 6,7 mRNA&#39;ların çoğunluğu ihraç ya da sinyal dizisi kodlama bölgesi (SSCR) 6 gibi spesifik RNA dizileri gerektirir şekilde olduğunu göstermek için kullanılmıştır . Bu testte, hücreler, sentezlenen mRNA veya ilgi genini içeren plazmid DNA ya in vitro microinjected . Microinjected hücreler, daha sonra sabit ve RNA alt hücresel yerleşimi BALIK kullanılarak değerlendirildi çeşitli noktalarında inkübe edilir. Transkripsiyon nükleik asitlerin yanı sıra birkaç saat sonra ortaya çıkar transfeksiyon, aksine, DNA veya mRNA mikroenjeksiyon hızlı ifade sağlar ve hassas kinetik verilerin üretimi için izin verir.

Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir tahlil<em&gt; In situ</em&gt; Memeli somatik hücre mRNA nükleer ihracat kinetiği doğru ölçmek için hibridizasyon.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

Ökaryotlarda, haberci RNA (mRNA) çekirdekte yazıya dökülür ve translasyon mekanizmasına erişebilmek için sitoplazmaya aktarılmalıdır. Her ne kadar ...

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerde mRNA nükleer eksport kinetiğini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mikroenjeksiyon yoluyla mRNA veya DNA enjekte edilerek gerçekleştirilir. Mikroenjeksiyonun ardından, örnekler çeşitli inkübasyon sürelerinden sonra fikse edilir.Ardından mRNA, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile boyanır. Prosedürün son adımı, hücrelerin görüntülenmesi ve sitoplazma ile çekirdekteki floresans miktarının belirlenmesidir. Nihayetinde, mRNA eksport hızı, mikroenjeksiyon ve floresan mikroskobinin kombinasyonu ile ölçülebilir.Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Alex Palazzo laboratuvarından SRG AV. Ben de yine Palazzo Laboratuvarı'ndan Stefan Toski. Ben Palazzo laboratuvarından Amy ve ben de Palazzo laboratuvarından Khi Maha David.Bugün sizlere, mikroenjeksiyon yoluyla memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mRNA aktarma prosedürünü göstereceğiz. Ayrıca, floresan in situ hibridizasyon ile mRNA'nın nasıl boyanacağını da uygulamalı olarak göstereceğiz. Laboratuvarımızda, memeli hücrelerdeki mRNA nükleer ihracat kinetiğini incelemek için bu prosedürleri kullanmaktayız.Öyleyse başlayalım. Mikroenjeksiyon öncesinde, önceden hazırlanmış plazma DNA'sını enjeksiyon tamponunda mililitre başına 50 ile 200 mikrogram arasına dilüe edin. Ardından, enjekte edilen hücrelerin tanımlanmasını sağlamak için karışıma 70 kilodalton dekstrana konjugle edilmiş Oregon Green 488 veya OG ekleyin.OG konjuge dekstran, sıvının ne kadarının çekirdeğe enjekte edildiğini ve ne kadarının sitoplazmaya sızdığını belirlemeye yardımcı olacaktır. İğne ucunu potansiyel olarak tıkayabilecek partiküler maddeleri çöktürmek için örnekleri 13.000 G ve dört derece Celsius sıcaklıkta en az 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Mikroenjeksiyon yapılacak memeli hücre hattını, yazılı protokol maliyetinde açıklanan kriterlere göre seçin.Bu gösterim tohumu için yedi hücre kullanılmaktadır. Hücreler, mikroenjeksiyondan en az 24 saat önce 30 milimetrelik Petri kaplarındaki asitle yıkanmış lameller üzerine yerleştirilir. İdeal olarak, enjekte edilen hücrelerin kolayca tanımlanabilmesi için enjeksiyon sırasında hücre monokatmanının yaklaşık %70 ila %90 konfluens düzeyinde olması gerekir; hücre monokatmanı, enjeksiyondan önce 200 mikrolitrelik plastik pipet ucu kullanılarak yaralanır.Lamel üzerine artı şeklinde bir çizik atın ve hücreleri enjeksiyondan önce doku kültürü inkübatöründe en az 15 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. Mikroenjeksiyon için, mikroenjeksiyon işlemini bozabilecek titreşimleri en aza indirmek amacıyla hava tablası üzerinde izole edilmiş bir ters mikroskop kullanın. Peleti bozmamak için, bir jel yükleme ucu kullanarak santrifüj örneğinin üst kısmından yaklaşık 1 µL sıvı alın.Pipetin ucunu önceden hazırlanmış bir mikroenjeksiyon iğnesinin arka kısmına yerleştirin ve sıvıyı boşaltın. Sıvı, kılcal etkiyle iğne ucuna çekilecektir. Beş ila 30 saniye içinde uç kısmına yakın bir menisküs görünür hale gelmelidir.Sıvı dolu iğneyi değneğin içine yerleştirin ve mikro manipülatöre sabitleyin. 10x objektif kullanarak iğneyi 45 derecelik bir açıyla görüntüleyin ve odak düzleminin yakınında, görüş alanının merkezine konumlandırın. Kaba mikro manipülatör düğmelerini kullanarak, değneğin bir tüp aracılığıyla bağlı olduğu ve sıvıyı iğne ucundan püskürtmek için gerekli basıncı oluşturmaya yarayan cam şırıngayı kullanın.Sabit bir basınç sağlamak için şırınga bir boru kelepçesine monte edilir. İğnenin sonraki adımlarda zarar görmesini önlemek için iki kauçuk tıpa ve iki metal kelepçe kullanarak iğneyi birkaç milimetre yükseltin ve ardından mikroskobu geri çekin. Şırınga pistonunu iterek basıncı artırın.0,5 ile iki santimetreküp arası. Yaralanmış bir monokatman içeren lamel bulunan bir Petri kabını yerleştirin. Gözlem aşamasında, mikroskobu geri çekin.Kondansatörün iğnenin sıvıya girmesini sağlayacak şekilde hizalanması için sütunu dik konuma getirin. İğnenin lamel üzerinde kırılmasını önlemek için bu işlem dikkatle yapılmalıdır. 10 x objektif kullanarak, çapraz sargının merkezini belirleyin ve iğneyi enjekte edilecek hücrelerin üzerine konumlandırın.40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın. Ardından, joystick üzerindeki ince ayar düğmelerini kullanarak iğneyi indirin ve merkezleyin. İğneyi çekirdekle temas edecek şekilde indirerek, yara artı işaretinin bir köşesinden enjeksiyona başlayın.Enjeksiyon yapıldıktan sonra, hücrenin faz parlaklığında belirgin bir değişim olur. Yara haçının bir kenarı boyunca devam edin. Görselleştirme sırasında enjekte edilen hücrelerin kolayca tanımlanabilmesi için, enjeksiyon basıncının her iğne için uygun şekilde ayarlanması kritik öneme sahiptir.Basınç, plazma ve nükleer membranları delecek kadar yüksek olmalı, ancak hücreleri öldürecek kadar yüksek olmamalıdır. Hücreleri, yara kenarı boyunca belirli bir süre boyunca mikroenjekte edin. Pratikle, bu süre zarfında birkaç yüz hücre enjekte edilebilir.Plazmid DNA enjekte ediliyorsa, fiksasyondan önce mikroenjeksiyon yapılan hücreleri bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 20 dakika inkübe edin, ardından transkripsiyonu sonlandırın. Hücreleri, büyüme ortamında çözünmüş 1 µg/mL α-amanitin ile muamele edin. Bu konsantrasyon, mikroenjekte edilen plazmidlerden transkripsiyonu etkili bir şekilde inhibe eder.Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin yeni sentezlenen mRNA'yı dışarı aktarmasına izin verin. Tek bir iğne, birden fazla lameli enjekte etmek için yeniden kullanılabilir. Ancak, mikroenjeksiyon yapılan DNA veya RNA tipi değiştiğinde iğnenin değiştirilmesi gerekir.Ayrıca, iğne wand'dan çıkarıldıktan sonra, mRNA nükleer dışa aktarım kinetiğinin doğru bir ölçümünü elde etmek için imha edilmelidir. Ayrı örnekler sıfırıncı dakikada, 15. dakikada, 30. dakikada, 60. dakikada ve 120. dakikada fikse edilmelidir. Uygun zamanda alfa manin uygulamasının ardından, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri iki mililitre PBS çözeltisi ile iki kez yıkayın.Lamel ve sıvı temasının kesildiği süreyi minimumda tutarak lamellerin nemli kalmasını sağlamak önemlidir. PBS içinde %4 Aldehit'ten iki mililitre ekleyerek hücreleri sabitleyin ve hücreleri oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. Sabitlenmiş örnekleri iki kez daha yıkadıktan sonra, PBS içinde %0,1 Triton X 100'den iki mililitre ile hücreleri permeabilize edin; hücreleri tekrar oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin.Son olarak, örnekleri hibridizasyona hazırlamak için iki kez daha yıkayın. Hücreleri, %25 ila %60 formamid içeren 1X SSC çözeltisinden oluşan bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, 150 mm'lik bir Petri kabının tabanını suyla kaplayıp üzerine bir parça parafilm yerleştirerek hibridizasyon için boyama hücresini hazırlayın.Kabı ters çevirerek suyu uzaklaştırın, böylece paraformun kabın tabanına yapışması sağlanır. Boyanacak her bir lameldeki hava kabarcıklarını manuel olarak giderin. Paraform üzerine 100 µL hibridizasyon çözeltisi damlatın.Formaj miktarının, kullanılan spesifik balık probu için pens yardımıyla optimize edilmesi gerektiğine dikkat edin. Sabitlenmiş hücrelerin bulunduğu lamelini 30 milimetrelik Petri kabından çıkarın. Watman filtre kağıdı kullanarak lamelin arka tarafını kurulayın ve hücreleri kurutmadan ön taraftaki fazla tampon çözeltiyi emdirin.Ardından, lamelini yüzü aşağı bakacak şekilde balık solüsyonunun üzerine yerleştirin. Bu işlemi her bir lamel için tekrarlayın. Boyama odacıklarının kapağını geri kapattıktan sonra, örnekleri 37 °C'de 5 ila 18 saat boyunca inkübe edin.Boyama odasının hazırlandığı yöntemle birkaç yıkama odası hazırlayın; her bir lamellenin üzerine yıkama odasındaki paraformun üzerine bir mililitre yıkama tamponu pipetleyin. İnkübasyonun ardından, bir mililitre yıkama tamponu pipetleyerek lamelleri boyama odasından çıkarın. Sıvı, kılcal etkileşimle her bir örneğin altına çekilmelidir.Ardından, lamel camlarını pensle çıkarın ve her birini beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmiş bir damla yıkama tamponu üzerine yerleştirin. Her bir lamel camını iki kez daha yıkayarak toplamda üç yıkama gerçekleştirin; önceden yıkanmış bir lam üzerine pens ve watman filtre kağıdı kullanarak dappy içeren 10 ila 30 µL montaj solüsyonu damlatın. Her lam iki lamel camı alabilir.Lamellerin arka yüzeylerini kurulayın ve numuneleri kurutmadan lamellerin ön yüzündeki fazla sıvıyı emdirerek alın. Her bir lameli, yüzeyi aşağı bakacak şekilde bir damla montaj çözeltisinin üzerine yerleştirin. Monte edilmiş numuneler dört degrees Celsius sıcaklıkta saklanabilir.Burada, farklı konsantrasyonlarda alfa mantin ile ön işlem uygulanmış NIH 3T3 fibroblast hücrelerinde, alfa mantinin enjekte edilen plazmid DNA transkripsiyonu üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Hücrelere TFL s delta i plazmid DNA ve OG konjuge 70 kilo dalton dekstran enjekte edilmiştir. Her satır, OG 70 kilodalton dekstran ve T uts delta I mRNA için görüntülenen tek bir görüş alanına karşılık gelmektedir.İlacın yüksek konsantrasyonlarının T UTS delta I transkript üretimini tamamen inhibe ettiği, düşük konsantrasyonlarda ise bunun gözlemlenmediği açıktır. Gösterilmiştir. Burada mRNA nükleer ekspor maliyetinin zaman seyri yer almaktadır. Yedi hücreye T UTS delta i plazmid DNA'sı ve OG konjuge 70 kilodalton dekstran enjekte edilmiştir.Enjekte edilen hücreler, 30 dakika sonra alpha mantin ilele işlem görmüş ve 37 °C'de sırasıyla 0 dakika, 60 dakika ve 120 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Hücreler daha sonra fikse edilmiş ve T UTS delta I mRNA'ya karşı bir prob ile ER markörü trap alpha'ya karşı antikorlar ile boyanmıştır; her satır tek bir hücre alanına karşılık gelmektedir.mRNA ihracatının nasıl nicelendirileceğine dair bilgi için lütfen buradaki çevrimiçi metne bakın. 120. dakika zaman noktası büyütülmüştür. TFS delta I mRNA'sının ER'deki kolokalizasyonunu göstermek için, yeşil renkteki T UTS delta I mRNA ve kırmızı renkteki trap alfa'nın üst üste bindirilmiş görüntüsü gösterilmiştir. mRNA'nın proteinlerle nasıl beraber boyanacağına dair bilgi çevrimiçi metinde bulunabilir.Size mikroenjeksiyon yoluyla mRNA'nın nükleer ekspor kinetiğinin nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, başarılı bir mikroenjeksiyonun uygun hazırlık gerektirdiğini unutmamak önemlidir. DNA ve RNA örneği hazırlama, iğne çekme, optik ekipmanların hizalanması ve mikroenjeksiyon sorun giderme gibi temel adımlar yazılı protokolümüzde açıklanmıştır.Mikroenjeksiyonla aktarılan mRNA görüntülenirken ve analiz edilirken, nicelleştirmenin, enjekte edilen sıvının %90'ından fazlasını çekirdeğe alan hücrelerle sınırlandırılması önemlidir. Başarılı bir çekirdek enjeksiyonu, organ green dekstranın çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımı görselleştirilerek değerlendirilebilir. Balık problarının tasarımı ve mRNA'nın sitoplazma ile çekirdekteki dağılımını analiz etmek için görüntü analiz yazılımının kullanımı hakkında daha fazla bilgi için lütfen çevrimiçi protokolümüze bakınız.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Büyük boyutları ve nispeten basit organizasyonları nedeniyle, Drosophila hemşire hücreleri canlı hücre görüntüleme çalışmaları için idealdir. Bu video, hücrelere eksojen bileşiklerin verilmesi için bir mikroenjeksiyon yöntemini açıklar ve öne çıkan protokol, endojen mRNA transkriptlerini görselleştirmek için kullanılan moleküler işaretler (MB'ler) adı verilen floresan oligonükleotid probları ile prosedürü gösterir.

Drosophila Hemşire Hücrelerinin Mikroenjeksiyonu: Bir Hücre İçi Dağıtım Yöntemi

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici...

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

İntronları snrnas Biogenesis çeşitli hücresel bölmeler içeren karmaşık bir süreçtir. Burada, hücrenin içindeki taşımalarını izlemek için floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu çalışılmış.

Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Öğrenin, memeli hücrelerde mikroenjeksiyon ve floresan in situ hibridizasyon kullanarak mRNA nükleer ihracat kinetiğini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, sitoplazma ve nükleus arasındaki mRNA hareketinin hassas kantitatif analizini sağlar.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

Daha fazla video keşfet