Farelerde Uykudan Uutanlığa Geçiş için Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu

Anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaksik bir çerçevede açıkta kalan bir kafatası ile sabitleyin.

Beynin stria terminalis (BNST) yatak çekirdeği, ışığa duyarlı katyon kanallarını eksprese eden viral olarak dönüştürülmüş nöronlar içerir.

Kafatasına delikler açın, optik fiberleri yerleştirin ve bunları destekleyici vidalar ve diş çimentosu ile sabitleyin.

Elektroensefalografi (EEG) ve elektromiyografi (EMG) elektrotları içeren bir düzeneği konumlandırmak için ek delikler açın ve yapıştırıcı ile sabitleyin.

EMG elektrot tellerini yerleştirmek için boyun kaslarını açığa çıkarın, ardından iyileşmeye izin verin.

Fareyi bir kayıt sistemine bağlayın, bir deney odasına yerleştirin ve uyku moduna geçmesine izin verin.

Işığa duyarlı katyon kanallarını etkinleştirmek için optik fiberden ışık iletin ve aksiyon potansiyelleri oluşturan katyon akışını tetikleyin.

Sinyaller uyku düzenleyici bölgelere yayılır ve uyanıklığı teşvik eder.

Beyin aktivitesini izlemek için EEG sinyallerini ve uykudan uyanıklığa geçişi gözlemlemek için kas aktivitesini tespit etmek için EMG sinyallerini kaydedin.

Elektroensefalogram veya EEG ve elektromiyogram veya EMG, elektrot implantasyonu için, önce EMG elektrotlarına her iki uçtan bir milimetre yalıtımın sıyrıldığı iki paslanmaz çelik teli lehimleyin ve elektrotların merkezini bregma üzerine yerleştirin. Ardından her EEG elektrodunun konumunu işaretleyin.

Fiber optik implantın konumunu belirlemek için, manipülatöre bir optik fiber yüksük takın ve manipülatör kolunu yatay bir çizgiye karşı artı veya eksi 30 derecelik bir açıyla döndürün. Fiber ucunu bregma üzerine koyun ve koordinatları kaydedin. Ucu hedeflenen yerleştirme çizgisine getirin ve kafatasındaki konumu ve yerleştirme yerinin yanındaki ankraj vidasının konumunu işaretleyin.

Kafatasını her bölgede delmek için diş matkabını kullanın ve optik fiberi BNST'nin üzerine ulaşana kadar nazikçe yerleştirmek için manipülatörü kullanın. Yüksük kalan kafatası üzerinde durmalıdır. Elyafı bir ankraj vidası ile kafatasına sabitleyin, durayı kırmamaya veya herhangi bir dokuya zarar vermemeye dikkat edin.

Daha sonra elyafı örtün ve ışıkla kürlenebilen diş çimentosu ile vidalayın. Ardından, EEG / EMG elektrotları için delikler açın ve ilk elektrotun ucunu bir deliğe yerleştirin. İmplantı bir elinizle tutarak, kafatası ile elektrot arasındaki boşluğa siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve herhangi bir dokuya zarar vermemeye dikkat ederek elektrodu geri kalan şekilde yerleştirin.

Tüm elektrotlar yerleştirildiğinde, yüksükte optik kabloya ve elektrotta kurşun tel bağlantı bölgelerine herhangi bir kesintiye neden olmamak için elektrotların ve optik fiberlerin çevresini ek siyanoakrilat yapıştırıcı ve siyanoakrilat hızlandırıcı ile kaplayın. Şimdi boyun kaslarını açığa çıkarın ve EMG elektrodunun tellerini kasın altına yerleştirin. EMG elektrodunun uzunluğunu, ense kaslarının hemen altına sığacak şekilde ayarlayın ve implantları daha fazla siyanoakrilat yapıştırıcı ve hızlandırıcı ile doldurun.

Ardından, fareyi tam tazminat alana kadar izlemeli bir ısı yastığının üzerine yerleştirin. Hedeflenen nöronların foto-uyarılması sırasında EEG / EMG izlemesi için, önce lazer yoğunluğunu ayarlamak için bir skaler kullanın ve lazer kablosunun ucunu kullanılmayan bir optik fibere bağlamak için bir halka kullanın. Fiber ile kablo arasındaki bağlantı noktasında boşluk olmadığını onaylayın.

20 dakika sonra, ısınan lazeri yoğunluk kontrol cihazına verin ve yoğunluğu milimetre kare başına 10 miliwatt'a ayarlayın. Işık darbesi süresini 10 milisaniyeye, dinlenme süresini 40 milisaniyeye, döngüyü 20'ye ve tekrarı 20'ye ayarlayın. Lazer modunu transistör mantığına değiştirin ve model düzenleyici tarafından kontrol edilen fiberden ışık darbelerinin yayıldığını onaylayın.

İmplante edilmiş elektrodu ve kablo adaptörünü bağlayın, ardından lazer sızıntısını önlemek için bağlantıyı ışık geçirimsiz malzeme ile kapatın. Lazer hazır olduğunda, fareleri EEG / EMG kaydı için deney odasına taşıyın. Hızlı olmayan göz hareketinden veya hızlı göz hareketi uykusundan uyanıklığa kadar olan gecikmeyi değerlendirmek için, kayıt süresini sınırlayın ve optimize edilmiş site kazanç süresini sınırlayın ve farelerin deney odasında en az bir saat boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.

Deney süresi boyunca, EEG ve EMG sinyallerini aynı kayıt ekranında izleyin. Farenin durumunu uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi uykusu veya hızlı göz hareketi uykusu olarak değerlendirin, her bir durumu ayırt etmeyi kolaylaştırmak için her dalga için kazanç kontrolünü kullanın. Hızlı olmayan göz hareketi uykusundan uyanıklık gecikmesine kadar ölçümü için, 40 saniye boyunca stabil hızlı olmayan göz hareketi uykusunu gözlemleyin, ardından fotostimülasyon için model üretecini açın ve implante edilen optik fiberlere lazer emisyonunu onaylayın.

Ardından, uyku durumu uyanıklığa dönene kadar EEG / EMG sinyallerini kaydedin.