JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:50 dk. • August 29th, 2025
Bir ısı bloğunda bir kriyoprotektan ile depolanan nöral progenitör hücreleri veya NPC'leri çözün.
Bu NPC'ler, Parkinson hastalığında önemli bir faktör olan artmış alfa-sinükleini eksprese eder.
Kriyoprotektanı seyreltmek için çözülmüş hücreleri ılık bazal ortam içeren bir tüpe aktarın.
Hücreleri peletlemek için santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın, ve peleti nöral ortamda yeniden süspanse edin.
Hücre süspansiyonunu ECM kaplı çok kuyulu bir plakaya ekleyin ve hücre yapışmasına ve çoğalmasına izin vermek için inkübe edin.
Kılavuz RNA, devre dışı bırakılmış Cas9-DNA metiltransferaz ve bir antibiyotiğe dirençli gen içeren lentiviral vektörler ekleyin.
Viral girişi, viral RNA'nın ters transkripsiyonunu, konakçı genomuna entegrasyonu ve transgen ekspresyonunu kolaylaştırmak için inkübe edin.
Kılavuz RNA, dCas9'u, metiltransferaz aracılı DNA metilasyonunun alfa-sinüklein ekspresyonunu azalttığı alfa-sinüklein genine yönlendirir.
Transdüksiyon yapılmamış hücreler apoptoza uğrarken, transdüksiyon yapılan hücreleri seçmek için medyayı antibiyotik içeren nöral medya ile değiştirin.
MD NPC'li bir Cryovial'i iki dakika boyunca 37 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin ve çözülmüş hücreleri 10 mililitre ılık DMEM-F12 içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri iki mililitre önceden ısıtılmış tam N2B2 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna iki mililitre N2B27 ekleyin ve önceden hazırlanmış BMM kaplı altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna iki mililitre hücre yerleştirin.
Hücreleri gece boyunca %5 CO_2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. MD NPC'ler %70 birleşim noktasındayken, iki mikro litre lentivirüs kılavuzu RNA d-Cas9-DNMT3A vektörü ekleyerek bunları dönüştürün ve plakayı hafifçe döndürün. Hücreleri daha önce olduğu gibi aynı koşullarda 16 saat inkübe ettikten sonra, transdüksiyondan 48 saat sonra N2B27 ortamını değiştirin.
Mililitre puromisin başına beş mikrogram ile N2B27 ekleyin