Name: Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Öğrenin, E. coli kültürlerinden plazmid DNA arındırma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli ve maliyet etkin bir saflaştırma süreci sunarak moleküler biyoloji araştırmalarında kaliteli DNA elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lizat Gümrükleme <ol><li> E. büyütün Luria Broth 37 gecede uygun antibiyotik ile derin kuyu plakaları istenen plazmid DNA (kültür / iyi 1 ml) ° C sallayarak ile dönüştürdü coli kültürleri. </li><li> 10 dakika boyunca 5.000 xg'de kültür plakası Pelet E. coli, sonra süzün süpernatant. </li><li> 100 mcL Tekrar Süspansiyonu Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 mikrogram / mL RNaz A) her pelletini tekrar. </li><li> 100 mcL / iyi Lizis Buffer (200 mM NaOH,% 1 SDS) ekleyin ve 2 dakika boyunca plaka çalkalayıcı kullanarak sallamak. </li><li> 100 kuyu / mcL Nötralizasyon Buffer (3.0 M potasyum asetat, pH 5.5) ekleyin ve 2 dakika çalkalanır. </li><li> Açıklama plaka lizat hücre lizat aktarın. </li><li> 350 mcL toplama plakası ve vakum manifoldunun altına yeri üstüne yerleştirin DNA bağlayıcı plaka. (Bkz. Şekil 1) vakum manifoldunun birleştirin. </li><li> Elektrikli cihazların üstüne yerleştirin lizat açıklama plakası. </li><li> 10 inç Hg (0,34 bar) vakum uygulayın ve DNA bağlayıcı plakasına süzüntü toplamak. Hg in 12 daha büyük vakum kullanmayın. (0.41 bar). </li><li> Vakum manifoldunun sökün. Aparat altına yerleştirin 2 mL atık toplama plakası. </li></ol> 2. DNA Bağlama <ol><li> (Bkz. Şekil 2) DNA bağlayıcı plaka manifoldunun üstüne taşıyın. </li><li> 300 mcL / iyi Bağlama Buffer (6 M Guanidin-HCl) ekleyin ve karıştırın ve aşağı yukarı pipetle. </li><li> Vakum uygulayın [~ Hg yavaş vakum inç 5 (0.17 çubuğu)] ve süzüntü atın. DNA membrana bağlı. </li><li> Yıkama Tamponu (80% Etanol) / iyi 400 mcL ile yıkayınız. </li><li> Vakum uygulayın, sonra süzüntü atın. 2 mL toplama plakası kullanılarak veya doğrudan atık filtreleme, gereksiz yere atın. </li><li> Tekrar bir kez yıkayın. </li><li> Leke alt kurumaya havluya filtre plaka. </li><li> Artık alkol kaldırılmasını sağlamak için 5-10 dakika bir kez daha vakum uygulayın. </li><li> Etanol damlacıkların kaldırılmasını sağlamak için alt kurutun. </li></ol> 3. DNA Elüsyon <ol><li> 70 kuyu / mcL Elüsyon Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) ekleyin. Yüksek DNA konsantrasyonu isteniyorsa, hacim 50 mcL / iyi olabilir, ama ortalama toplam verim düşük olacaktır. </li><li> Plaka, bir dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Arıtılmış DNA ya vakum veya santrifüj tarafından yıkandı, olabilir. </li><li> Vakum yöntemi: Vakum manifoldu içine yerleştirin temiz toplama plakası (DNaz, RNaz ücretsiz). Tüm elüsyon tampon DNA bağlayıcı plaka geçti kadar vakum manifoldunun üstüne koyun filtre plakası, 15 inç Hg (0,5 bar) 1 dakika için vakum uygulamak. Saflaştırılmış DNA (bkz. Şekil 3) toplayın. </li><li> Santrifüj yöntemi: 5 dakika 1000 xg'de temiz toplama plakası ve santrifüj üst üste yerleştirin arıtma filtre plakası. </li></ol> 4. Nicel ve Nitel Analiz <ol><li> OD 260/280 ölçün, saflaştırılmış DNA konsantrasyonu hesaplar. </li><li> Saflaştırılmış pDNA agaroz jel analizi gerçekleştirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar E. coli, malzeme başlayan enkaz kayda değer bir azalma gösterdi geleneksel santrifüj ve Pall AcroPrep Advance lizat açıklama Filtre Tabaklar kullanarak açıklık lizat . (Şekil 4). Üç konsantrasyonlarda Plazmid DNA TE tampon içine çivili ve AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası üzerinden geçti. Plazmid DNA konsantrasyonunun karşılaştırılması, filtrasyon öncesi ve sonrası, gösteriler üç konsantrasyonlarda% 100 iyileşme (Şekil 5) ~. Açıklık E. DNA kurtarma göstermek için coli lizat, plazmid DNA ham lizat çivili ve daha sonra filtrasyon ile duruluğu . Aynı plazmid DNA, hücre lizat aşağıdaki filtreleme eklendi. Elektroforez her bir örnek (Şekil 6) hacimde yapıldı. Her numune benzer şiddette bir tek, net bant filtreleme tabanlı açıklama adımı sırasında biraz varsa DNA kaybı göstermektedir. Kültürler E. pCAT plazmid DNA içeren coli E. arınmış coli Pall Kullanıcı mcL 350 ve 1 ml DNA bağlayıcı Filtre Tabaklar, 350 mcL DNA bağlayıcı plakaların yanı sıra diğer iki marka lizatları. Üreticinin tavsiye ettiği protokolde belirtildiği gibi tüm arındırmalardan yapıldı. Yüksek DNA konsantrasyonu ve toplam verim Pall 1 ml AcroPrep Advance DNA arıtma filtresi plaka (Şekil 7 ve Tablo 2) görülür. Rakip W yüksek DNA konsantrasyonu (155 ng / ml) göstermesine rağmen, toplam DNA verimi (4.7 mikrogram / iyi) düşük kurtarma hacmi nedeniyle düşük olduğu, ~ 30 mcL. Rakip M 108 DNA düşük konsantrasyon verdi ng / toplam 5.6 mg / iyi bir verim ile mcL. Agarose jel üç farklı DNA bağlayıcı plakaları pCAT saflaştırılmış DNA analizi Şekil 8'de gösterilmiştir. Her toplanan numune hacmi elektroforez önce kurtarma hacmi farklılıkları düzeltmek için 65 mcL ayarlandı. Tüm numuneler plazmid DNA supercoiled gösterir, ancak her Filtre Tabaklar DNA verimi değişir. Şekil 9 hazırlanan DNA supercoiled formu ve benzeri konsantrasyon gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Lizat netleştirilmesi için vakum Manifold Meclisi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. DNA Ciltleme için vakum Manifold Meclisi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Vakum Elüsyon için vakum Manifold Meclisi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Filtrasyon örnek açıklama kolaylaştırır. Vakum filtrasyonu (350 mcL AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası) veya geleneksel santrifüj açıklık ham lizat 300 mcL üç nüsha örnekleri. OD 320 açıklama öncesi ve sonrası ölçülmüştür. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. PDNA AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası geçişi sonra tam iyileşme. 300 mcL TE tampon, 25, 50 ve 100 mikrogram / mL pCAT ile çivili. DNA konsantrasyonu ve kurtarma, K = 2 öncesi ve filtrasyon sonra OD 260 hesaplanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Açıklama sonra pCAT DNA Kurtarma. Eşit miktarda, açıklama öncesinde veya sonrasında lizat içine çivili pUC19 sonra TE tamponunda 10 1 seyreltilmiş. % 1.2 agaroz jel üzerinde 2 mcL / şeritli yüklendi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7. Pall Acroprep Advance DNA rakip plakalar daha bağlayıcı filtre plakası ile ortalama Yüksek plazmid DNA verim 1 ml (Pall ve Rakip M) veya 1.5 mL (Rakip W) bir gecede kültürü ile gösterilir DNA arıtma plakaları kullanılarak pCAT plazmid DNA verimi (OD 260) DH5α. Plaka üreticinin tavsiye protokolü kullanılarak saflaştırılması. Hata çubukları standart hata (n&gt; 6) işaret etmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8. PCAT DNA agaroz jel analizi belirtilen DNA bağlayıcı plaka saflaştırılmış. Saflaştırılmış pDNA% 1.2 agaroz jel elektroforezi. Örnekleri, üç ayrı arındırmalardan Pooled eluat arıtma, seyreltilmiş 01:10 sonra 65 mcL ayarlanır. Hat başına 2 mcL yüklendi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="Şekil 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 9"> Şekil 9. Kalite ve santrifüj veya vakum yöntemleri saflaştırılmış pDNA son eluat toplama agaroz jel elektroforezi için kullanılan benzer saf dna kurtarma. PDNA arıtma AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar için üreticinin tavsiye ettiği protokol izledi. Elüsyon, 2 dakika için 15 inç Hg (0,5 bar) ile 5 dakika veya vakum 1000 xg'de santrifüj tarafından yapıldı.

Bu video makalenin yazarları, video ve metin özellikli cihaz ve reaktiflerin üreten Pall Yaşam Bilimleri çalışanları.

Biz çeşitli avantajları tanıyor AcroPrep Advance Filtre Tabaklar facile, aerodinamik protokol açıklar. Bu yöntem, manuel, yarı otomatik veya tam otomatik AcroPrep Advance biçimlerde işlenmiş, maksimum plazmid DNA verim sağlar. Lizat açıklık plaka üzerinde entegre bir ön filtre örnekleri, hatta partikül bu içeren yüksek düzeyde tutarlı filtrasyon sağlar. , Daha hızlı, daha düzgün bir plaka üzerinde minimal tutma hacmi ile filtrasyon hızları plaka sonuçlarının iyi geometri ve çıkış uç geometrisi, çapraz kontaminasyon endişeleri olmaksızın alıcı plakasına doğrudan numune akışı sağlar. Önemlisi, AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar DNA bağlayıcı plaka yüksek bağlama kapasitesi membran yüksek kalite plazmid DNA maksimum kurtarma için optimize edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>AcroPrep Advance Filtre plakası</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8175 (1 mL) veya PN 8075 (350 &amp;#181;l)</td><td>berraklaştırma için 3 &amp;#x03BC;m cam fiber 0.2 &amp;#x03BC;m Supor&amp;#174; membran</td></tr><tr><td>AcroPrep Advance Filtre Plakası</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8132</td><td>DNA Bağlama için</td></tr><tr><td>Vakum manifoldu</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 5017</td><td></td></tr><tr><td>Vakum basınç pompası</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 13157</td><td></td></tr></tbody></table>

prokaryotik kültürler itibaren plazmid dna aerodinamik arıtma

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Biz prokaryotik kültürünün başlangıç ​​ve yüksek saflıkta DNA ile biten, 96 plazmid hazırlıkları için AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar süreci tanımlamak. Bakteriyel lizat açıklık ve DNA saflaştırma için çok iyi filtrasyon dayanarak, bu yöntem plazmid hazırlanması için akıcı bir süreç oluşturur. Silika-tabanlı medya içeren Filtre plakalar, vakum filtrasyon veya santrifüj plazmid DNA kayda değer miktarda verim kolayca işlenebilir. Nicel analiz saflaştırılmış plazmid DNA 1.97 ortalama OD 260/280 oranları ile yüksek kalitede sürekli olarak belirler. Genel olarak, sıralama ve klonlama gibi downstream uygulamalar için daha saf DNA plazmid verim sunuyoruz. Aerodinamik AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar kullanarak bu yöntem, manuel, yarı otomatik veya tam otomatik işleme sağlar.

Bu protokol, verimli paralel açıklama ve plazmid DNA arıtma için uygun maliyetli bir alternatif<em&gt; E. coli</em&gt; Kültürler. AcroPrep Advance sürecinin yüksek bir bağlama kapasitesi DNA bağlayıcı filtre plakası arıtma ile optimize edilmiş bir lizat açıklama filtre plakası ile başlar.

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

Prokaryotik kültürden başlayıp yüksek... ile sona eren, 96 plazmit preparasyonu için AcroPrep Advance Filtre Plakalarının tüm sürecini açıklıyoruz.

<a class="grey_button" href="/video/2711"> Çince </a>

streamlined-purification-of-plasmid-dna-from-prokaryotic-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Plazmid DNA Qiagen Miniprep Kit kullanarak Bakteri kolonileri Arındırıcı

Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Doğrusal kovalent kapalı (LCC) DNA minivektörü (DNA ministring), yüksek transfeksiyon verimliliği sunan viral olmayan bir gen dağıtım vektörüdür ve herhangi bir DNA dağıtım uygulamasıyla ilgilidir. Üretim sistemi basit, hızlı ve in vivo olarak ölçeklenebilir. Aşağıdaki protokol, DNA mini dizilerinin üretimi için görsel adım adım talimatlar sağlar.

Çift şeritli DNA Ministrings üretimi

Bu makale, ekstrakromozomal dairesel DNA'yı (eccDNA) saflaştırmak için Circle-Seq adı verilen hassas bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, kolon saflaştırmayı, kalan doğrusal kromozomal DNA'nın çıkarılmasını, yuvarlanan daire amplifikasyonunu ve yüksek verimli dizilemeyi kapsar. Circle-Seq, ökaryotik eccDNA'nın genom ölçeğinde taranması ve genom kararsızlığı ve kopya sayısı varyasyonunun incelenmesi için geçerlidir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

İn vivo montaj, DNA parçalarını homolog rekombinasyon yoluyla birleştirmek için bakterilerdeki içsel DNA onarım enzimlerine dayanan, ligasyondan bağımsız bir klonlama yöntemidir. Bu protokol hem zaman hem de maliyet etkindir, çünkü az sayıda reaktif gereklidir ve klonlama verimliliği %99'a kadar çıkabilir.

Yüksek Verimli Plazmid Yapımı için In Vivo Montaj Kullanımı

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Mevcut çalışma, kromozom dizisi zaten biliniyor veya ilgi çekici olmayan plazmidlerin nanopore dizileme iş akışını açıklıyor. Başlangıçta bir plazmid DNA zenginleştirme adımı, optimal plazmid dizisi derinliğini sağlar ve akış hücresi başına dizilenebilen örnek sayısını maksimize eder.

Nanopore dizileme tabanlı iş akışları kullanarak uzun okuma plazmid dizileme ve montajı

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Öğrenin, E. coli kültürlerinden plazmid DNA arındırma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli ve maliyet etkin bir saflaştırma süreci sunarak moleküler biyoloji araştırmalarında kaliteli DNA elde edilmesini sağlar.

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

Daha fazla video keşfet