Name: Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin nöronal büyüme konilerinde F-aktin dikenli uçlarını rodamin-aktin ile görüntüleme yöntemini. Saponin permeabilizasyonu ve floresan mikroskopi kullanarak aktin dinamiklerini nicel olarak analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr James Bamburg ve bu çalışmalarda işbirliği için onun laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu çalışma NIH hibe HD19950, EY07133 ve Minnesota Tıp Vakfı&#39;nın bağışları ile finanse edilmiştir.

Rodamin aktin etiketleme için, nöron, ya da "video" yemekler içine yapıştırılmış lamelleri 35 mm plastik tabaklar altına yerleştirilen cam lamelleri kültür. 1. Lameller hazırlanması ya da "Video" Yemekleri <ol><li> Birçok nöron tipleri, in vitro yüzeylerde kötü yapıştırıcı. Bu prosedür için gerekli olan Cam lamelleri, yeterli nöron-substrat yapışma yeterince temizlenmeli ve hazır olmadıkça izin vermeyebilir. Banker ve Goslin tarafından düzenlenen kitap Kültürleme Sinir Hücreleri, asit, cam lamelleri yıkama ve temizlik için detaylı bir prosedür açıklanmıştır. Alternatif olarak, heyecanla substrat moleküllerine bağlanır lamelleri, nitroselüloz kaplama aşağıdaki adımları 1.7 ve 1.8 olarak açıklanmıştır. </li><li> Cam lamelleri (örneğin 18 mm kare veya 24 mm daire) dH 2 O durulanır ve organik izlerini silmek için pişmiş kuru ısı mümkün olduğunca (≥ 225 ° C) ve uzun (birkaç gün en az üç ay veya daha uzun). bileşikler. 1.6 veya 1.3 'e devam video yemekler için adıma gidin. </li><li> Yüksek çözünürlük videomicroscopy için ince bir açık cam yüzey oluşturmak için, uygun çaplı bir elektrik mantar matkap kullanarak (ya da benzeri bir aletle) 35 veya 50 mm plastik Petri veya doku kültürü yemekleri dipleri yuvarlak delikler delinir. Sondaj plastik çatlamasını önlemek için hafif bir baskı ile yavaş yavaş yapılır. Her iki tarafta da düzgün bir yüzey oluşturmak için açılan deliğin kenarları makas ile kazınır. </li><li> Cam lamelleri, 1.1 veya 1.2 'de açıklandığı gibi doku kültürü kullanmak için temizlenir. Lameller, toksik olmayan silikon akvaryum çimento (18x18mm lamelleri, 12mm çap biti kullanılır) kullanarak, deliklerinin üzerine yapıştırılır. Çimento, 24 saat boyunca tedavi. </li><li> (Steril koşullar aşağıdaki adımları kullanılarak yapılır) video yemekler steril dH 2 O 3 kez yıkanır ve kurumaya izin. </li><li> Lameller nöron kültürü için substrat molekülleri ile kaplanmıştır. İlk olarak, lamel yüzey (18x18 lamel için 250 mcL) ile 100 mikrogram / mL PBS nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör 4-8 saat (veya gece) poli-D-lisin bir çözüm kaplanmıştır. Lameller sonra steril dH 2 O ile poli-D-lizin bağlanmamış kaldırmak için 3 kez yıkanır ve kuru hava izin. Birçok nöron tipleri, kültür ortamında serum proteinlerine dahil edildikleri takdirde, poli-D-lizin yalnız ile kaplı lamelleri kültüre. Ancak, in vivo koşullarda daha alakalı sonuçlar doğal substrat molekülleri kullanılarak elde edilir. Laminin, fibronektin veya L1 CAM (1-20 mcg / ml PBS içinde) olarak bu moleküller Çözümleri, 4-8 saat veya gece için poli-D-lizin kaplı lamelleri doğrudan uygulanabilir ama bizim laboratuvarda rutin olabilir kat, hücre adezyon moleküllerinin protein substrat bağlama artırmak için uygulamadan önce nitroselüloz ince bir film tabakası ile hazırlanan lamelleri. </li><li> % 1, 5 ml% 100 amil asetat 5 g nitroselüloz eriterek nitroselüloz çözüm olun. 10 mcL lamel bu çözümü uygulayın ve hafifçe üzerine yayıldı. Hava kuruması 10 dakika. </li><li> 25 mcg / ml laminin veya 4 mg / ml PBS içinde L1 CAM ve nitroselüloz yüzeyine yayılmış bir çözüm 250 mcL uygulayın. Nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör, aspirat substrat (veya gece) 4 saat inkübe ve kültür ortamı hemen eklemek Yüzey kuru değildir. </li></ol> 2. Nöronal Kültürler hazırlanması <ol><li> Embriyonik gün 7 civciv embriyosunda yumurtadan kaldırılır ve kültür ortamı içeren bir stereomikroskopta kullanarak, toraks ve karın iç organları kaldırmak için diseksiyon için% 10 serum ile 100 mm petri kaplarına yerleştirilir. </li><li> Embriyolar daha sonra orta ile durulanır ve sıvı besiyerinde 60 mm çanak taşındı ve daha dorsal kök gangliyon (DRG) veya nöral retina dokuları eksplantlar kaldırmak ve hazırlamak için disseke edilir. Hollenbeck ve Bamburg tarafından düzenlenen Hücre Biyolog, Yöntem ve Uygulamalar: Hücre Biyolojisi, hacim 71, Nöronlar ayrıntılı bir diseksiyon açıklamasına Yöntemleri olabilir. DRG eksplantlar 1/2-whole ganglionlar ve retina eksplantlar sinir çapı 1 mm veya daha az. </li><li> Eksplantlar gereksiz dokular temizlendikten sonra, bireysel eksplantlar kültür ortamı ile kültür yemekler zaten lamelleri, forseps saatçiler, taşınır. Diseksiyon mikroskobu altında, eksplant inkübatör taşıma sırasında hareket etmesini önlemek için forseps ile lamel merkezinde hafifçe bastırılır. Eksplantlarındaki B27 katkı maddeleri, 10 mM HEPES pH 7.4 ile tampon ve nemlendirilmiş bir 38 ° C inkübatör gecede yerleştirilen F12 orta kültür. Büyüme faktörleri gerektiği gibi kültür ortamı, katma olabilir. E7 DRG eklendi nörotrofinler olmadan eksplantlar nöronların aksonları uzatacaktır rağmen nörotrofinler genellikle, eski embriyolardan kültürlerin DRG eklenir. Nöral retinanın eksplantlarındaki olmadan bu kültür ortamında aksonlar uzatmakbüyüme faktörleri dding. </li><li> Kültürler yeterli aksonal akıbet aşağıdaki prosedürü başlamadan önce izin vermek için en az 18 saat süreyle inkübe edilir. </li></ol> 3. Rodamin aktin Permeabilization Tampon Hazırlanması <ol><li> 138 mM KCl, 10 mM BORU, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2 ve% 1 BSA (pH = 6.9) içeren permeabilization tampon stok çözelti 4 ° C11 2 hafta kadar saklanabilir. Kullanmadan önce son bir konsantrasyon için aşağıdaki bileşenleri eklenir:% 0.025 'saponin, 0.1 mM ATP ve 100 nM Alexa-Florlu 350 Phalloidin. </li><li> Ayrı bir çözüm de bu aynı bileşenleri kullanmak artı 0.45μM rodamin olmayan kas aktin çözüm dönüşümlü vortekslenmiş rodamin-aktin kümeleri çözmek için 5 dakika için tritrated hemen önce taze olarak hazırlanır ve ilk permeabilization adımı sırasında 1 dakika için vortekslenmiş tüp içinde polimerizasyonu önlemek için. Buna rağmen, tüp filament montaj Sorun devam ederse, çözüm kullanmadan önce santrifüj olabilir. </li></ol> 4. F-aktin Dikenli Ends üzerine rodamin-aktin Nöronal Kültürleri ve Ortaklığın Permeabilization <ol><li> DRG veya retina eksplantlar ile bir kültür çanak dikkatle inkübatör kaldırılır ve aşağıdaki adımları oda sıcaklığında yapılır. </li><li> Çözümleri tüm değişiklikler dikkatle yapılmalıdır. Pipet lamel kenarında yer olmalıdır ve çözümler kaldırılır ve yavaş yavaş ve az güç ile eklenmelidir. </li><li> Kültür ortamı dikkatle pipet tarafından kaldırılır, fakat istikrarlı ve hücreleri karşılamak için yeterli permeabilization tampon 1 dakika (18mm x 18mm lamel ~ 60 mcL) eklenir. Kültür permeabilization tampon eklemeden önce başka herhangi bir çözümleri ile durulanır ve lamel permeabilization tampon eklemeden önce kurumasına izin değildir. </li><li> Permeabilization tampon yavaşça pipet tarafından kaldırılmış ve 4 dakika süreyle 0.45 mcM rodamin olmayan kas aktin içeren permeabilization tamponu ile değiştirilir. </li><li> % 4 paraformaldehid (laboratuvar notu, fosfat tamponu, pH 7.3 ile yapılan),% 0.05 glutaraldehid ve% 10 sukroz bir çözüm ekleyerek rodamin-aktin içeren tampon hafifçe pipet tarafından kaldırılır ve nöronlar sabit. 5 dakika fiksasyon sonra lamelleri hafifçe PBS ile durulanır, ve 3-inç cam slaytlar Slowfade monte. </li><li> Değişen çözümlere alternatif bir yaklaşım, bir akış hücresi kullanmaktır. Bu piyasada bulunan akış hücresi olabilir, ya da basit bir akış hücresi ayırıcılar olarak lamel köşelerinde küçük plastik parçaları (≤ 1 mm kalınlığında) koyarak ve daha sonra üst eşit büyüklükte bir lamel montaj olabilir lamel. Çözümler akışını hücrenin bir tarafında pipet yerleştirerek ve diğer tarafında bir fitil (pamuk veya Kimwipe) ile çözümler çekilerek değiştirilebilir. </li><li> Üzerine rodamin-aktin, F-aktin dikenli sona erer ve büyüme konileri F-aktin floresan-Phalloidin etiketleme dahil, 60X immersiyon yağı hedefi ile epi-floresans optik ile görüntülendi ve görüntüleri soğutmalı bir CCD kamera kullanılarak toplanır. Konfokal mikroskop gelişmiş görüntüleme sağlayabilir. </li><li> Rodamin-aktin dahil en iyi ölçümü için her görüntü için dijital kamera hassasiyeti aynı kazanç ve pozlama ayarlarını kullanarak tüm görüntüleri tek bir oturumda toplanan olmalıdır. Her görüntünün eşdeğer bölgelerden gelen etiketleme analizi yapılmalıdır; Metamorph, Resim J veya benzer bilgisayarlı görüntü analizi için araçlar kullanılabilir. </li></ol> BU İŞLEMİ VE DEĞİŞİMLER 5. Bir Varyasyon: Canlı Hücre Görüntüler rodamin-aktin Etiketleme önce toplayın <ol><li> Video yemekler ısıtılmış bir mikroskop sahneye yerleştirilir, ve canlı büyüme konisinin görüntüleri toplanır. Izgara lamelleri kullanılabilir, ya da gravür ve / veya kalem işaretleri lamel etiketleme sonra belirli hücreleri bulmak için daha kolay yapılabilir, veya video çanak prosedürün süresi için mikroskop sahnede yerinde sabit olabilir. </li><li> Rodamin-aktin Permeabilization, birleşme ve hücre sabitleme ya da mikroskop sahneden ya video çanak yapılır. Düzeltmeden sonra, PBS, hemen görüntüleme için video yemekleri eklenir. Daha sonra görüntüleme için örnek korumak için, slowfade montaj orta lamel eklenir ve eşit büyüklükte bir lamel yavaşça (baloncuklar kaçınarak) üstüne yerleştirilir ve kenarları, sonra da açık bir oje ile mühürlenir. </li></ol> 6. Varyasyon İki: Co-etiket Ek Proteinler İmmünokimya <ol><li> (4.2-4.4) Yukarıda açıklandığı gibi rodamin-aktin birleşme ve fiksasyon, lamelleri veya video yemekler kültüre nöronlar yapılabilir. </li><li> Fiksasyon sonra, PBS içinde durulama, hücreler 15 dakika PBS içinde 0.1 M glisin ile tedavi edilen ve daha sonra çıkarılan% 0.1 Triton X-100, 1 saat süreyle% 2 keçi serum ve% 1 BSA ile PBS (TX-100) Lameller1 saat için% 1 BSA içeren PBS ile sulandırılmış primer antikorlar ile inkübe Lamelleri sonra durulanır ve 1 saat için% 1 BSA ile PBS 1:1000 dilüsyon floresan sekonder antikor uygulamadan önce% 2 keçi serum ve 1 saat süreyle% 1'lik BSA ile PBS TX-100,% 0.1 'inkübe Durulandıktan sonra, lamelleri tekrar 30 dakika süreyle% 2 keçi serum ve% 1 BSA ile% 0.1 TX-100 PBS içinde inkübe durulanır ve anti-solmaya orta monte edilmiş. Bazı proteinlerin lokalizasyonu, ilk permeabilization adım (4.3) tarafından bozulur. Bu proteinlerin antikorlar ile lokalizasyonu,% 0.05 paraformaldehid ve% 0.05 glutaraldehid korumak için dikenli rodamin-aktin sonuna etiketleme etkilemeden (rodamin-aktin eklemeden önce yani) 1 dk permeabilization tampona eklenmiş olabilir. </li><li> Üçlü etiketli büyüme konileri Görüntüler floresan veya konfokal mikroskopi toplanır. </li></ol> 7. Varyasyon Üç: F-aktin Ücretsiz Dikenli Ends Rehberlik Cues Etkilerinin Değerlendirilmesi <ol><li> Bir büyüme faktörü veya rehberlik işaret inkübatör çanak kaldırılması ve permeabilization yordama başlamadan önce, birkaç dakika için birkaç ng / ml (ya da uygun bir tedavi süresi) konsantrasyonları inkübatör kültür yemekleri eklenir. Bu F-aktin ücretsiz dikenli ucunda büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları kısa vadeli etkilerinin değerlendirilmesi sağlar. </li><li> Isınmış bir mikroskop sahnede yer nöronal kültürlerin bir video çanak ve büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları permeabilization ve rodamin aktin dahil başlamadan önce bir büyüme konisi yakınındaki bir degrade bir mikropipet serbest olabilir. Örneğin, NGF nöral retina ganglion hücrelerinin nöron veya Netrin DRG için serbest bırakılabilir. Pipet permeabilization prosedürü başlamadan önce 1-2 dakika gibi kısa bir sokulabilir. Bu büyüme konisi önde gelen marjları (resimler için referans atıf 10) F-aktin ücretsiz dikenli biter oluşumu üzerine bir hidayet işaret degrade yerel etkilerin değerlendirilmesi sağlar. </li><li> Bu varyasyonlar, yukarıda 6.2 'de açıklandığı gibi, diğer nöronal bileşenleri antikor-aracılı etiketleme ile kombine edilebilir. </li></ol> 8. Varyasyon Dört: transfekte Nöronlar F-aktin Ücretsiz Dikenli Sona Etiketleme <ol><li> RNAi (floresan tanımlayıcı işaretleyici) ile yapısal olarak aktif ya da dominant-negatif yapıları veya protein demonte kullanımı F-aktin ücretsiz dikenli biter düzenleyen bir protein katılımı değerlendirmek için kullanılabilir. Protein, büyüme konisi içinde bulunduğu lokalizasyona bağlı olarak, floresan etiketi erimiş ise, transfekte hücreler, floresan ifade protein permeabilization üzerine kaybolmuş olabilir. Bu durumda, video yemekleri transfekte hücreli mikroskobik permeabilization önce bir tanımlamak için kullanılan olabilir ve permeabilization transfekte hücrelerinin konumları işaretleme sonra mikroskop sahnede yapılabilir. Alternatif olarak, GFP-aktin inşa ilgi GFP-inşa co-transfekte olabilir. Bu durumda, GFP-aktin F-aktin içine dahil olacak ve permeabilization sonra transfekte hücrelerinin kimlik sağlayan, permeabilization kayıp olmayacak. </li><li> Bu değişim, yukarıda 7,1-7,3 açıklandığı gibi, rehberlik ipuçlarının ilavesi ile kombine edilebilir. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. NGF, Küresel ek DRG bir büyüme konisinin 5 dakika boyunca sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılır, aktin polimerizasyonu önde gelen marjı uyarılır. Toplam F-aktin ve büyüme konisinin önde gelen marjı F-aktin dikenli biter artar ve rodamin-aktin etiketleme parlak bir grup, büyüme konisi çevre etrafında görülür. Şekil 1 unstimulated DRG büyüme konisi ve NGF-uyarılmış DRG büyüme konisinin içine rodamin-aktin dahil karşılaştırır. Birleştirilen görüntülerin yeşil floresan Phalloidin büyüme konisinin etiketleme ve F-aktin kırmızı rodamin-aktin etiketleme. Dikenli sonuna etiketlenmesi için iyi bir kontrol, 4.2 ve 4.3 adımları permeabilization tampon 10-6 M veya daha yüksek cytochalasin B veya D eklemek için. Cytochalasins kap F-aktin dikenli biter ve dikenli biter rodamin-aktin bağlayıcı inhibe ederler. Bu ciddi rodamin-aktin hücre içine dahil azaltmak veya ortadan kaldırmak gerekir. Ölçek barlar, 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. NGF degrade yerel F-aktin dikenli biter artar. Bültenleri NGF DRG büyüme konisi, F-aktin ücretsiz dikenli biter etiketleme 2 dakika boyunca bir tarafında getirilen olduğunu mikropipet. Aşağıdaki resimler NGF bir degrade yerel pipet yakın büyüme konisi bölgenin F-aktin ücretsiz dikenli biter artışa yol açar maruz kalmanın göstermektedir. Birleştirilen görüntünün yeşil Phalloidin gösterirve kırmızı rodamin-aktin. Ölçeği bar, 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Aktif ERM proteinler büyüme konisinin önde gelen marjı birikir. Phospho-Ezrin/Radixin/Moesin İmmünositokimyasal etiketleme (Perm), F-aktin ücretsiz dikenli biter . ERM yerelleştirme korumak için bir dakika süreyle ilk permeabilization tampon gluteraldehid (% 0.05) ve paraformaldehid (% 0.05) eklendi. Rodamin-aktin, kırmızı; PERM, yeşil; Phalloidin, mavi. Ölçeği bar, 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Aktin polimerizasyonu uyarılması aktif ERM proteinleri gerektirir. Grubuyla DRG'ler GFP-aktin ve GFP kontrolü plazmid ya da dominant-negatif Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) inşa birlikte transfekte edildi. GFP-aktin permeabilization sonra transfekte hücrelerinin belirlenmesini sağlar. Burada, NGF F-aktin dikenli biter etiketleme önce 5 dakika eklendi. DN ERM ile transfekte büyüme konisi, yakındaki bir untransfected büyüme konisi (alt paneller) ile tezat büyüme konisinin önde gelen marjı (alt-orta panel), ya da dikenli sonuna GFP kontrolü (üst orta panelde) seviyeleri azalttı. Rodamin-aktin, kırmızı, GFP-aktin, yeşil. Ölçek barlar, 10 mm.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+Understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+P+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).</li>
<li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+and+go%3A+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobio%22%5BJournal%5D)">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li>
<li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li>
<li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li>
<li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li>
<li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Sci+Inter%22%5BJournal%5D)">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li>
<li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin%3A+A+functional+node+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li>
<li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ADF%2Fcofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li>
<li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li>
<li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li>
</ol>

Yöntemleri, büyüme konileri geçiş önde gelen marjı aktin hücre iskeletinin dinamik remodeling katılan hücresel bileşenlerinin zamansal ve mekansal çözünürlükte izin sundu. NGF veya Netrin gibi cezbedici molekülleri, hızla aktin filament polimerizasyonu teşvik etmek için Şekil 1 ve 2&#39;de gösterildiği gibi aktin dikenli biter aktif ADF / cofilin 10 aktin filament kesilmesinin tarafından oluşturulan yerel bir artış, eylem olarak ortaya çıkıyor. Bu yöntem radixin, Şekil 3 ve 4 resimde bir ERM protein, büyüme k...

<table><tbody><tr><td>18x18 mm lamel</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>35mm Petri kapları</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Akvaryum çimentosu</td><td></td><td>DAP %100 silikon akvaryum sızdırmazlayıcısı</td><td>Herhangi bir yapı market</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (mw &amp;gt; 300,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>Doğal fare laminini</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine kas dışı aktin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>F12 Kültür ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade </td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

nöronal büyüme konileri permeabilize rodamin-aktin ile f-aktin dikenli ends etiketleme

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Büyüyen aksonlar hareketli ipuçları büyüme konileri denir. Büyüme konileri, gelişmekte olan dokularda büyüme konisi reseptörlerine bağlanır ve yerel dinamikleri ve büyüme koni hücre iskeletinin 3-6 organizasyonu düzenleyen ifade edilen moleküler rehberlik ipuçları ile etkileşim yoluyla aksonlar seyreden yol açmaktadır. Bu seyir sinyallerinin ana hedefi, büyüme konisi çevre ve aktin polimerizasyonu sürekli ve dinamik bir yeniden şekillenme 7 ile bu sürücüleri büyüme konisinin motilite doldurur aktin filament ağda . Pozitif ya da çekici rehberlik ipuçları uyarıcı aktin filament (F-aktin) cezbedici işaret kaynağı yakın büyüme konisi çevre bölgede polimerizasyonu dönüm büyüme konisi neden olur. Bu aktin polimerizasyonu sürücüler, önde gelen marjı ve cezbedici doğru aksonal uzama yerel büyüme konisi çıkıntı, yapışma. Aktin filament polimerizasyon yeterli aktin monomer durumu ve ek monomer polimerizasyonu çekirdekleri veya aktin filament dikenli biter bağlıdır. Aktin monomeri civciv retina ve dorsal kök gangliyon (DRG) büyüme konileri bol miktarda mevcuttur. Sonuç olarak, F-aktin dikenli biter monomer eklenmesi için kullanılabilir hale polimerleşme hızla artmaktadır. Bu daha yakın bir cezbedici 8-10 büyüme koni bölgede faktörü (ADF / cofilin) ​​depolymerizing F-aktin kesilmesinin protein aktin yerel aktivasyon ile civciv DRG ve retinal büyüme konileri oluşur . Bu artan ADF / cofilin aktivite, yeni F-aktin polimerizasyonu için dikenli biter oluşturmak için aktin filamentler koparır. Aşağıdaki yöntem bu mekanizma ortaya koymaktadır. F-aktin Toplam içerik floresan Phalloidin ile boyanarak görünür hale getirilir. F-aktin dikenli uçları diğer hareketli hücreler 11, 12, önceki çalışmalarda adapte aşağıdaki açıklanan prosedüre permeabilize büyüme konileri içinde rodamin-aktin kuruluş tarafından görüntülenmiştir. Rodamin-aktin, aktin monomeri dikenli biter eklenmesi için kritik konsantrasyon üstünde bir konsantrasyon eklendiğinde, rodamin-aktin ücretsiz dikenli uçları üzerine toplanır. Çekici ipucu gibi bir büyüme konisinin bir tarafa yerleştirilmiş bir mikropipet serbest bırakılması gibi bir degrade, sunulan ise, F-aktin dikenli uçları üzerine rodamin-aktin katılması doğru mikropipet 10 büyüme konisinin tarafında daha fazla olacaktır . Büyüme konileri küçük ve narin hücre yapıları. Permeabilization, rodamin aktin dahil, fiksasyon ve floresan görselleştirme işlemleri titizlikle yapılmaktadır ve ters bir mikroskop sahnede yapılabilir. Bu göç eden nöronlar, diğer birincil doku hücrelerinin veya hücre hatları yerel aktin polimerizasyonu eğitim yöntemleri uygulanabilir.

Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

Büyüyen aksonların hareketli uçlarına büyüme konileri denir. Büyüme konileri, yerel olarak ... ile etkileşime girerek, gelişmekte olan dokular boyunca yol alan aksonlara rehberlik eder.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, aksonal yönlendirme ipuçlarına maruz bırakılan nöronal büyüme konilerinde, aktin polimerizasyonu için mevcut olan serbest f aktin dikenli uçların konumlarını ve sayılarını görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle lamel camlar üzerinde kültüre edilen nöronların, büyüme konilerini geçirgen hale getirmek için saponin içeren bir tampon çözelti ile yıkanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından hücreler, rumen aktinin büyüme konilerine girmesine ve serbest f aktin dikenli uçlar üzerinde polimerize olmasına izin vermek için dört dakika boyunca rumen aktin içeren bir tampon çözeltiye maruz bırakılır.Son olarak, F aktin dağılımını korumak amacıyla hücreler kimyasal olarak fikse edilir ve durulanır. Rumine aktin dahil eden tırtıklı uçlar. Floresan mikroskobu ve kantitatif görüntü analizi temelinde, çekici kılavuz sinyallerin serbest f efektin sayısını artırdığını gösteren sonuçlar elde edilir.Göç eden büyüme konilerinin ön ucundaki barbed uçlar. Merhaba, ben Minnesota Üniversitesi Tıp Fakültesi Nörobilim Bölümü'nden Paul Erno. Bugün civciv nöronal büyüme konisi kültürlerinin hazırlanışını göstereceğiz.Embriyolar içinde sinaptik hedeflerine yönelirken aksonları ileriye

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nöron dendritler gibi karmaşık hücre şekilleri, geliştirme sırasında nasıl elde edilir anlamak için, bu, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler mikrotübül organizasyonu, trakea, kas incelemek için sağlam bir immünohistolojik bir etiketleme yöntemi açıklamak ve...

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Bu video, mikroskopi için sıçan kortikal nöronlarının floresan olarak boyanması prosedürünü göstermektedir. Yapısal bütünlüğü analiz etmek ve nöronal fonksiyon ve sağlığı incelemek için çok önemli olan F-aktin yoğunluğunu hesaplamak için F-aktin ve dendritik proteinleri hedefler.

Sıçan Kortikal Nöronlarında Filamentli Aktin Punktasının Miktar Tayini

Kaynak: Alluri, H.,  et al. Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyonunu İncelemek İçin İn Vitro İskemi-Reperfüzyon Yaralanma Modeli Olarak Oksijen-Glikoz Yoksunluğu ve Reoksijenasyon. J. Vis. Uzm. (2015). Video, sıçan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinde (RBMEC'ler) sıkı bağlantı proteinlerinin ve stres liflerinin floresan lokalizasyonunu göstermektedir. Stresli tek tabakada, sıkı bağlantı proteinlerini etiketlemek için floresan etiketli antikorlar kullanılırken, florofor etiketli falloidin stres...

Endotel Hücrelerinde Sıkı Bağlantı Proteinlerinin ve Stres Liflerinin Floresan Lokalizasyonu

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Filamentli aktin (F-aktin), spinogenez, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitede önemli bir rol oynar. F-aktin punkta'nın miktar tayini bu nedenle sinaptik yapıların bütünlüğünü incelemek için yararlı bir araçtır. Bu protokol, düşük yoğunluklu primer kortikal nöronal kültürlerde Phalloidin ile etiketlenmiş F-aktin punktasının miktar tayini prosedürlerini açıklar.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Öğrenin nöronal büyüme konilerinde F-aktin dikenli uçlarını rodamin-aktin ile görüntüleme yöntemini. Saponin permeabilizasyonu ve floresan mikroskopi kullanarak aktin dinamiklerini nicel olarak analiz edin.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

Daha fazla video keşfet