Bir Model Proteinin Termal Açılması Yoluyla Bakteriyel Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Öncelikle bir küvet, sıcaklık kontrollü bir küvet tutucu ve karıştırıcı ile donatılmış bir floresans spektrofotometresine yerleştirin.

Orta derecede asidik pH ile önceden ısıtılmış tampon ekleyin ve tutucu sıcaklığını stres koşullarını simüle etmek için ayarlayın.

Test örneğine, E. coli'den türetilen asit koruyucu bir chaperon ekleyin.

Kontrol örneğinde eşit hacimde tampon ekleyin.

Sonra, her iki numuneye sıcaklık ve asit hassasiyetli bir alt tabaka proteini eklenin.

Işık saçılmasını izlemeye başlayın.

Örnekleri stres koşullarında kuluçka altına alın ve substratın açılmasını teşvik edin.

Orta derecede asidik pH olduğunda, chaperon aktif hale gelir ve katlanmamış proteini stabilize eder.

pH nötralize edici tuz çözeltisi ekleyin ve ışık saçılmasını kaydetmeye devam edin.

Kontrol örneğinde, nötr pH'a dönüş, katlanmamış proteinin toplanmasına neden olur ve ışık saçılmasını artırır.

Test örneğinde, chaperon substratın yeniden katlanmasını teşvik eder ve bu da kontrol modeline kıyasla daha az ışık saçılmasına neden olur.

Işık saçma sinyallerini karşılaştırarak refakatçi aktivitesini değerlendirin.

Bir mililitrelik kuvars küvetini, sıcaklık kontrollü numune tutucuları ve karıştırıcılarla donatılmış bir floresan spektrofotometresine yerleştirin.

Uyarılma ve emisyon dalga boyunu 350 nanometreye ayarlayın. İstenilen pH değerlerinde önceden ısıtılmış tampon D'nin uygun hacimlerini küvete ekleyin. Toplam hacim 1.000 mikrolitredir.

Küvet tutucusunun sıcaklığını 43 derece Celsius'a ayarlayın. Tampona 12,5 mikromolar HdeB ekleyin, ardından 0,5 mikromolar MDH eklenin. Işık saçılmasını izlemeye başlayın.

MDH'nin yeterince açılmasını sağlamak için reaksiyonu 360 saniye kuluçka edin. İki molar tamponlanmamış dipotasyum fosfatın 0,16 ila 0,34 hacmi ekleyerek pH değerini yediye yükseltin ve ışık saçılmasını 440 saniye daha kaydetmeye devam edin. Metin protokolünde açıklandığı gibi verileri analiz edin.