Opsonize Kırmızı Kan Hücreleri Kullanarak In Vitro Komplement Aracılı Fagositoz Modellenmesi

IgM ile opsonize edilmiş koyun kırmızı kan hücrelerini (SRBC) ve hücre yüzeyi antijenlerine bağlı IgM antikorları alın.

C5 hariç komplement proteinleri içeren serum ekleyin.

C1 kompleksi antikorlara bağlanır ve aktif hale gelir.

Aktive C1, C4 ve C2'yi parçalar, C3 dönüştürücü oluşturur; bu dönüşümaz C3'ü parçalayıp C3b'yi SRBC'lere biriktirir.

C5 olmadan C3b C3bi'ye ayrılır.

SRBC'leri makrofaj kültürüne ekleyin.

C3bi, makrofaj reseptörüne bağlanır ve SRBC fagositozunu tetikler.

Lizlere hipotonik bir çözelti ekleyin ve içselleştirilmemiş SRBC'leri çıkarın.

Hücreleri lizlemek ve SRBC hemoglobini salgılamak için liz tamponu ekleyin.

Bir algılama reaktifini tanıtın.

Ürea varlığında, hemoglobin diaminoflorenin hidrojen peroksit tarafından oksidlenmesini katalize eder ve renkli bir ürün üretir.

Renkli ürünün emilimini ölçün, bu da fagositozlu SRBC'lerle orantılıdır.

Bu test, antikor etiketli bakterilerin fagositozunu opsonize SRBC'ler kullanarak bakteriyel hedefleri taklit eder.

Opsonizasyon testi için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 mikrolitre tavşan anti-SRBC immünoglobulin M veya IgM ile 2 kat 10 ile sekizde bir koyun kırmızı kan hücresi veya SRBC inkübe yapın.

Daha sonra opsonize SRBC'leri, 37 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca 50 mikrolitre C5 eksikli insan serumu ile inkübe ederek IgM kaplı SRBC'lerde C3b ve C3b inhibitör komplement parçalarını sabitleyin.

Sonra, ortamı aspire edin ve her kuyu başına 1 kat 10 oranında bir mikrolitre, bir yarı kültürlü fare makrofajı içeren her bir kuyuya 1 kat 10 mikrolitre, mililitre ortamda yedi opsonize SRBC'ye ekleyin.

SRBC fare makrofaj kokültürünü 37 derece Celsius'ta 1 saat boyunca inkübe edin ve ardından bağlanmamış SRBC'leri 100 mikrolitre amonyum klorür-potasyum lizis tamponu ile 1 dakika boyunca yıkayarak çıkarın.

Bağlanmamış SRBC'ler çıkarıldıktan sonra, 100 mikrolitre medya ile durulayın. Kalan hücreleri %0,1 sodyum dodesil sülfat ile lizize edin ve lizatları %3 hidrojen peroksit ve 6 molar üre ile takviye edilmiş 50 mikrolitre 2,7-diaminofloren ile işleyin.

Daha sonra hemoglobinle katalize edilmiş floren mavisi oluşumunun 620 nanometre spektrofotometrede emilimini ölçün.

Fagositize olan opsonize SRBC sayısını belirlemek için bilinen sayıda SRBC ile 620 nanometre absorbans değerinde standart bir eğri kullanın.