JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 4:19 dk • February 2nd, 2026
Caenorhabditis larvalarının ilgilenilen bakterileri bağırsak lümenini kolonileştirdiği bir kültür plakası alın.
Tabak, bilinen bir bakteri sürünü yiyecek olarak içerir. Solucanları aç bırakarak tüm bakterileri tüketip uyku aşamasına girerler.
Bir ortam ekleyin ve solucanları bir tüpe aktarın.
Santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
Bir deterjan çözeltisi ekleyin, yüzeye yapışan bakterileri çıkarmak için karıştırın, tekrar santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
Yıkamayı tekrarlayın, ardından solucanları taze bir kültür tabakasına aktarın.
Sürünmeye, yüzeyden ve bağırsak lümeninden gevşek bağlı gıda bakterilerini çıkarırken, bağırsakta istikrarlı bir şekilde kolonileştiren ilgilenen bakterileri korurken.
Gıda bakterilerinin tamamen ortadan kalkmasını sağlamak için transfer ve sürünme adımlarını tekrarlayın.
Malzemeyi ekleyin, solucanları bir saat camına aktarın ve bağırsaklarını açığa çıkarmak için disseksiye yapın.
İlgilendiğiniz bakterileri içeren bağırsakları disseksiye, su dolu tüplerde toplayın ve gelecekte kullanmak üzere dondurun.
Solucanları aç bırakmak ve OP50-1 bakteri sayısını azaltmak için, nematodları 20 derece Celsius sıcaklıkta üç ila dört gün kuluçka edin. M9 ortamından 5 mililitre yeni aç kalmış solucanların plakasına ekleyin, ardından M9 ortamı ve solucanları steril 15 milimetrelik santrifüj tüpüne aktararak oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.000 kat g ile aşağı dönerler.
Solucanları beş kez yıkamadan önce, %0,05 Triton X-100 içeren 10 mililitre M9 ile Nutator üzerinde 20 dakika boyunca silin. Son yıkamadan sonra, 100 mikrolitre çözelti içindeki peleti rahatsız etmeden üst yüzeyi çıkarın ve M9 ile solucanları tohumlanmamış 6 santimetrlik NGM plakaya aktarın. Solucanlar 20 dakika boyunca sürünürken plakayı kurutmaya bırakın, böylece kütikül ve bağırsaktan OP50-1 çıkarılır.
Plaka kuruduğunda, prosedürü tekrarlayın; 250 mikrolitre M9 ekleyip solucanları yeni, tohumlanmamış 6 santimetrlik bir NGM plakaya aktarın; böylece solucanlar kurudukça sürünebilir.
20 dakika sonra, plakaya 250 mikrolitre M9 ekleyin ve 100 mikrolitre M9'u kurtlarla birlikte temiz bir saat camına aktarın.
Sonra nematodların kafasını 26 gauge bir şırınga iğnesi ile kesin ve solucanı başka bir 26 gauge şırınga iğnesi ile tutun.
Kafası kesildikten sonra, bağırsak, granül bir kütle ve şeffaf gonat doğal olarak nematod bedeninden uzaklaşır, ardından açıkta kalan bağırsaktan bir parça kesilir ve tek bir diseksiyon edilmiş bağırsak 10 mikrolitre steril su içeren 0,5 mililitrelik PCR tüpüne aktarılır. Prosedürü tekrarlayarak en az beş farklı hayvanın bağırsaklarını PCR tüplerinde toplayın.
PCR tüplerini en az 5 dakika boyunca eksi 80 derece Celsius'ta dondurun. Bağırsak örneklerini eritin, ardından PCR ve tanımlama için dizileme işlemi yapılır.