Legionella pnömofila dış zar veziküllerinin ultrasantrifüj tabanlı izolasyonu

Dış zar vezikülleri salgılayan patojenik Gram-negatif bir bakteri olan Legionella pneumophila kültürüne başlayın.

Bu OMV'ler, bakteriyel virülansa katkıda bulunan lipopolisakkaridler ve membran proteinleri taşır.

Kültürü santrifüjle ederek sağlam bakterileri pellet haline getirin.

OMV'leri içeren süpernatantı toplayıp tekrar santrifüj ederek pellet kalıntısı bakterileri elde edin.

Süpernatantı bir membrandan filtreleyerek kalan bakterileri uzaklaştırarak OMV'leri tutun.

Bakteri kalıntılarını çıkarmak için taze bir zar kullanarak ikinci bir filtrasyon yapın.

Bakterisiz filtratı topla ve OMV'leri pellet etmek için ultrasantrifüj yap.

Süpernatantı at, pelleti tamponda tekrar askıya alın ve gevşek ilişkili proteinleri ve lipopolisakkaritleri çıkarmak için tekrar ultrasantrifüj yapın.

Süpernatantı çıkarın ve saflaştırılmış OMV'leri tampon içinde tekrar askıya alın.

OMV'lerin bir aliquotunu kan agarı ve BCYE agar plakalarına çizin ve kuluçka yapın.

Koloni oluşumunun olmaması, bakteriyel kontaminasyonun olmadığını doğrular.

OMV'leri konak-patojen etkileşim çalışmaları için düşük sıcaklıkta sakla.

Kalan sıvı kültürü 90 mililitre taze YEB ortamına ekleyin ve kültürü döner bir shaker üzerinde inkübe yapın, OD₆₀₀ 3.0 ile 3.5 arasında bir seviyeye ulaşın. Sıvı kültürü 4.000 g ile 20 dakika boyunca santrifüjlenerek bakterileri peletleyin. Sonra süpernatantı yeni santrifüj tüplerine aktarın.

Bakteriyel pelletleri atın ve örnekleri tekrar santrifüjle edin, ardından santrifüj adımını bir kez daha tekrarlayın. Sonra, kalan süpernatantı iki kez filtre sterilize edin.

Daha sonra bakterisiz süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve örnekleri 100.000 g sıcaklıkta , 4 derece Celsius'ta 3 saat boyunca döndürün. Süpernatantı boşaltın ve atın. Sonra steril PBS kullanarak OMV peletlerini tekrar süsküye alıp biriktir.

Ultrasantrifüjleme adımını tekrarlayarak kirletici proteinleri ve serbest LPS'yi çıkarabilirsiniz. Şimdi, süpernatantı atın ve ultrasantrifüj tüpünü steril pamuk çubukla kurutun. OMV pelletini 500 mikrolitre steril PBS ile yeniden askıya alın.

Sonra, hazırlanan vezikülün bakterisel kontaminasyonunu önlemek için kan agar ve BCYE agar plakalarına 20 mikrolitre damla sürülür. Kan agar plakasını gece boyunca, BCYE agar plakasını ise 3 gün boyunca kuluçka edin.