JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 4:02 dk. • February 2nd, 2026
Patojenik bakterilerle enfekte olan bir fare beyninden alınan toplam RNA alın. Ekstrakt, enfeksiyona duyarlı genlerin transkriptlerini içerir.
DNA bozucu bir enzim ekleyin ve genomik kalıntı DNA'yı bozgunlaştırmak için kuluçka yapın.
Ters transkriptaz (RT) enzimi, nukleotidler ve spesifik olmayan primerler içeren bir master karışım ekleyin.
Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezlemek için kuluçka yapın.
RT enzimini inaktive etmek için yüksek bir sıcaklık ekleyin.
DNA polimeraz, nükleotidler, çift zincirli DNA bağlayıcı boya ve hedef gene özgü primerler içeren bir master karışım alın.
cDNA'yı ekleyin ve DNA'yı denatüre etmek için ısı uygulayın.
Astar, hedef cDNA'ya bağlanarak yeni DNA zinciri sentezini sağlar.
Döngü, hedef genin güçlendirilmesi için tekrarlanır.
Boya, amplifikasyonlu DNA'ya bağlanır ve her döngünün sonunda kaydedilen floresans yayar.
Floresansın artması, enfekte fare beyninde enfeksiyona yanıtlı genin ifadesini doğrular.
Tüm fareleri planktonik hücreler veya biyofilm durum hücreleri kullanarak enfekte edin ve metin protokolünde tanımlandığı gibi ötenazi yapın. Sonra, beyin dokusundan toplam RNA'yı RNA çıkarma kiti kullanarak çıkarın.
Her fare için, RNA çıkarmak için tüm beyin dokusu kullanın. Tüm beyin dokusunu beş tüpe ayırın. 100 miligrama kadar beyin dokusu alın ve kit tarafından sağlanan liz matrisini içeren her tüpe 1 mililitre liz çözeltisi ekleyin.
RNA'yı metin protokolünde listelenen adımları takip ederek çıkarın. Sonra, ters transkripsiyon reaktif kitiyle termosikler kullanarak genomik DNA'nın eliminasyonu da dahil olmak üzere cDNA sentezi gerçekleştirin. 2 mikrolitre genomik DNA eliminasyon tamponu ve 1 mikrolitre genomik DNA eliminasyon enzimi içeren tüpe 1 mikrogram RNA ekleyin.
RNase içermeyen suyu 10 mikrolitre ulaşana kadar ekleyin. 42 derece Celsius'ta 2 dakika kuluçka yapın. Reaksiyon çözeltisine 10 mikrolitre master karışım ekleyin ve ardından nazikçe karıştırın.
Tüpü 37 derece Celsius sıcaklığında 15 dakika boyunca koyarak hemen ters transkripsiyon reaksiyonuna geçin. Sonra reaksiyonu 5 saniye boyunca 85 derece Celsius'a aktarın. Gerçek zamanlı PCR makinesi ve siber nicel gerçek zamanlı PCR kiti kullanarak nicel gerçek zamanlı PCR analizini gerçekleştirin. Kit talimatlarını takip ederek, enzim, primerler, 50x ROX referans boya iki ve cDNA şablonu birleştirin. Sonra RNase içermeyen su ekleyin ve toplam hacmi 20 mikrolitre ulaşın.
Her örneği metin protokolünde listelenen termal parametrelerle üçlü olarak çalıştırın ve iki eksi delta delta delta CT yöntemine göre göreli katlanma değişimini hesaplayın.