JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:12 dk. • January 30th, 2026
Her biri GFP kodlayan plazmid taşıyan, diğeri ise efektör protein kodlayan iki Agrobacterium tumefaciens süspansiyonunun eşit hacimli karışımını alın.
Bir delik açın ve iğnesiz bir şırınga kullanarak karışımı sağlıklı, tamamen genişlemiş Nicotiana benthamiana 16c yapraklarının alt yüzeyine sızdırın.
Fazla süspansiyonu yumuşak doku ile kapatarak bakteri aşırı büyümesini önleyin.
Sızan alanları işaretleyin ve bitkileri optimal büyüme koşullarında kuluçkaya geçirin.
Agrobakteriyel , plazmid DNA'larını bitki hücrelerine aktarır; burada GFP ve efektör genler mRNA'lara transkribe edilip proteinlere çevrilir.
Tesisin savunma sistemi, dupleks siRNA'ların RISC'ye yüklendiği RNA susturmasını kullanır. Yolcu ipliği çıkarılır ve kılavuz ipliği kompleksi hedef GFP mRNA'yı bozmaya yönlendirir.
Ancak, efektör proteinler siRNA'lara bağlanır, bu da RISC ile ilişkilerini engeller ve GFP floresansının devam etmesini sağlar.
Bu, bitki RNA'sının susturulmasını bastıran patojenlerin tespitini sağlar.
35S yeşil floresan protein içeren bir Agrobakteriyel kültürün, 35S salatalık mozaik virüsü baskılayıcı 2b, varsayılan efektör veya boş vektör içeren Agrobakteriyel kültürü ile eşit hacimlerde karıştırın. 1 mililitrelik iğnesiz bir şırınga kullanarak, Nicotiana bethamiana 16c yapraklarının abaksiyal taraflarındaki karışık Agrobakteriyel süspansiyonları dikkatlice ve yavaş bir şekilde sızdırın.
Yapraklardan kalan bakteriyelleri yumuşak doku mendil ile çıkarın ve infiltrasyon yapılan yamaların kenarlarını işaret kalemiyle çevreleyin.