Yenidoğan fare dalak fagositleriyle bakteriyel öldürmenin in vitro değerlendirmesi

Yenidoğan fare dalaklarını mekanik olarak ayırarak tek hücreli bir süspansiyon oluşturarak başlayın.

Süspansiyonu bir tüpe aktarın, santrifüj yapın ve süspansiyonu çıkarın.

Eritrositleri yok etmek için pelleti lizis tamponu içinde yeniden askıya alın.

Tampon ekleyin, tekrar santrifüj yapın ve üst maddeyi çıkarın.

Hücreleri tamponda yeniden süslüyor ve nötrofiller ve inflamatuar monositlerde ifade edilen bir reseptörü hedefleyen antikor kaplı manyetik mikroboncuklarla kuluçka için.

Santrifüj yapın ve bağlanmamış boncukları çıkarın. Tampon ekleyin, ardından süspansiyonu ferromanyetik bir sütundan geçirin ve boncuk bağlı hücreleri tutmak için manyetik alan uygulayın.

Manyetik alanı kaldırın, hücreleri tampon ile elüasyon yapın ve çok kuluklu bir plakaya tohumlayın.

Seçilen kuyulara artan konsantrasyonlu parlak bakteriler ekleyin.

Nötrofiller ve monositlerin bakteriyi fagositoz yoluyla içselleştirmesi için kuluçka yapın.

İçselleştirilmeyen bakterileri yok etmek için ortamı antibiyotik içeren medyayla değiştirin.

Bakteriyel içselleşmeyi ve fagositoz tarafından indüklenen sonraki öldürmeyi değerlendirmek için düzenli aralıklarla lüminesansı kaydedin.

In vitro bakteriyel öldürme testi yapmak için, enfekte edilmemiş dalağı 5 mililitre PBS içeren steril 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirilir ve %10 fetal sığır serumu ile desteklenir, steril 3 mililitrelik bir şırınga pistonu kullanarak dokuyu tek hücre süspansiyonuna ayırır. Hücreleri 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjle toplayın. Pelleti, 3 ila 4 dalak başına 1 mililitre kırmızı kan hücresi lizin tamponunda yeniden askıya alın.

Oda sıcaklığında 5 dakika sonra dalağı PBS ile yıkayın ve pelleti 250 mikrolitre PBS'ye, sığır serum albümini ve saymak için 2 millimolar EDTA ile takviye edilmişte yeniden askıya alın. Sonra, Ly6 B2 pozitif hücreleri üretici protokolüne uygun immünomanyetik boncuklarla izole edin ve zenginleştirilmiş Ly6 B2 pozitif hücreleri, 100 mikrolitre tam ortam başına 100 mikrolitre 5 hücre oranında, siyah veya beyaz 96 kuyu delikli bir plakada tohumlayın. İstenen enfeksiyon çokluğunda bakteriyel inokulumu 100 mikrolitre nihai hacimde hazırlayın ve her kuyuya 100 mikrolitre bakteriyel inokulum veya ortam ekleyerek hücre kültüründe 1 saatlik kuluçka için.

İnkubasyonun sonunda, ortamı 200 mikrolitre taze tam ortam ile değiştirin, ardından mililitrede 100 mikrogram gentamisin takviyesi yapılarak kalan ekstrasellüler bakteriler gider ve hücreler hücre kültürüne ek 2 saat boyunca geri döndürülür. Kuluçkanın sonunda ve sonrasında her deneysel zaman noktasında, bir plaka okuyucu kullanarak kapalı kültür plakasının her kuyruğundaki lüminesansı ölçersin ve ardından plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine bir sonraki ölçüme kadar geri döndürün.