Bitki Hücrelerine Gen Taşıması İçin Agrobakteriyel Kültürünün Hazırlanması

Kontaminasyonu önlemek ve plazmid tutumunu sağlamak için iki antibiyotikle takviye edilmiş ortamda yetiştirilen Agrobacterium tumefaciens kültürü ile başlayın.

Bakteriler, ilgi çekici bir gen taşıyan bitki ekspresyon vektörü ve antibiyotik direnç geni içerir.

Ayrıca, ilgilenilen genin bitki hücrelerine taşınması için gerekli olan virülans genlerinden oluşan bir bölgeye sahip yardımcı plazmid içerirler.

Bir parçayı, asetosyringon, bitkisel kaynaklı bir sinyal molekülü ve antibiyotiklerle desteklenen tamponlu bir ortam içeren tüpe aktarın. Sallama ile kuluçka yapın.

Asetosiringon hücreye difüzyon yapar, sinyal yolunu tetikler ve ilgilenilen genin transferi için gerekli virülans genlerinin ekspresyonunu aktive eder.

Kültürü transfer edin, bakterileri toplamak için santrifüj yapın ve süpernatantı atın.

Bir tuz tamponu ekleyin ve hücreleri tekrar tekrar yıkarak eklenen antibiyotikleri çıkarabilirsiniz.

Bakterileri asetosyringon ile tampon içine yeniden süsle ve virülans gen ekspresyonunu korumak için sarsıntı yapmadan kuluçka yapın.

Verimli dönüşüm için kültürü hemen kullanın.

Bir uç kullanarak LB plakasından pozitif bir koloni seçin ve hücreleri, 5 mililitre LB ortamı içeren bir cam tüpte aşılayın; bu tüple mililitrede 50 mikrogram Kanamisin ve mililitrede 50 mikrogram Rifampisin takviyesi yapılacaktır. Hücreleri 30 derece Celsius sıcaklığında, 200 RPM'de 24 ila 48 saat boyunca sallayarak büyütün.

Kültürden 100 mikrolitre, aynı antibiyotiklerle takviye edilmiş 5 mililitre LB ortamına, pH 5.6'da 10 milimolar MES'ye ve 20 mikromolar AS ile aktarın. Bakteriyi 30 derece Celsius'ta 200 RPM'de 16 ila 20 saat boyunca sallayarak büyütün. Hücreleri 4.000 kez g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti 2 mililitre 10 milimolar magnezyum klorür tamponunda yeniden süskü altına alın.

Antibiyotiklerin tamamen alınmasını sağlamak için yıkamayı tekrarlayın. Agrobakteriyel kültürünün yoğunluğunu optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçerek belirleyin. Hücre kültürünü 10 milimolar magnezyum klorür tamponu ile 1.5 ila_{2.0 oranında OD 600'e} ayarlayın.

Son süspansiyon kültürüne pH 5.6 seviyesinde 10 milimolar MES ve 150 mikromolar AS ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında en az 3 saat boyunca sarsıntı olmadan kuluçka edin.