Bakteriyel Enfeksiyonun Görselleştirilmesi İçin Fare Mesanesi Dokusu Hazırlanması

Patojenik bakterilerle önceden enfekte olmuş, açıkta bir mesane olan ötanazi edilmiş bir fareyle başlayın.

Bakteriler ürotelyumu işgal eder ve koloniler oluşturur. Olgunlaştığında, bu bakteriler epitel hücresini yıpar ve çevredeki hücreleri enfekte eder.

Fiksator dolu bir şırıngaya bağlı bir kateter takın. Yavaşça mesanesi şişirmek ve mimariyi korumak için fiksatif yerleştirin.

Fiksantörü korumak ve mesane şeklini korumak için üretrayı kelepçe edin.

Kateteri çıkarın, sonra üretrayı kesin. Mesanesi yeni fiksatora aktarın ve yapıyı korumak için kuluçka yapın.

Mesaneti ürotelyumu açığa çıkarmak için iki yarım mesane kabına ayrılın ve bir tampon ile durulayın.

Kontrastı artırmak için metal bazlı bir reaktifle boyan, ardından ultrasaf suyla yıkayın.

Bölümleri etanol gradyanı kullanarak kurutun, ardından kritik noktada kurutma yapın.

Her kurumuş mesane bardağını ikiye böl.

Örnek artık konak-patojen etkileşimlerini görselleştirmek için aşağı akış işlemeye hazırdır.

Tuberkülin slip-tip şırıngasını fiksatif ile kullandıktan sonra, ucuna bir kateter takın, enfeksiyon işaretlerinin karşısına bakacak şekilde eğimli bir kateter takın.

Fazla boruyu iğnenin ucundan 1 ila 2 milimetre mesafede kesin, iğne ucunu açığa çıkarmamaya dikkat edin. Şırıngayı hafifçe sallayarak kabarcıkları çıkarın ve pistonu boş havaya itin. Sonra kateteri mikrosantrifüj tüpü üzerinden fiksatif ile doldurun. Anestezi yapıp fareyi kurban ettikten sonra, bacaklar sabitlendikten sonra, farenin pelvik bölgesini pens ve cerrahi makasla açarak mesaneyi açığa çıkarın. Yanındaki yağı dikkatlice kenara itin ama mesaneyi yerinde bırakın.

Şırıngayı baskın elinizle iğneyi aşağıya doğru tutun. Kateter ucunu steril kayganlaştırıcıya batırın ve kateter ucunu üretra açıklığına yerleştirin; şırınga namlusunu fare gövdesinin üzerinde 30 ila 45 derece açı altında tutun.

Saat yönünde hafif bir hareketle aşağı basınç uygulayın ve kateteri nazikçe üretraya yerleştirin. Kateter ucu girerken, şırıngayı farenin kuyruğuna doğru menteşeleyin ve kateteri üretraya daha da kaydırmaya devam edin, şırınga namlusu çalışma yüzeyine paralel hale getiresiniz. Tüm kateter iğnesinin şaftı fareye girmeli ve kateter ucu mesane lümeninin içine yerleştirilmelidir. Yavaşça 50 ila 80 mikrolitre fiksator verin ve mesane balon gibi şişirir.

Kateteri yerinde tutun ve şırıngayı hafifçe kaldırın, ucunu yukarı kaldırın. Diğer elinizle hemostatı açın ve bir uçu üretra kesişimindeki kateter iğnesinin altına kaydırın. Hemostat kısmen kapatıp iğneyle temas edene kadar kapatın.

Kateter iğnesini mesaneden nazikçe dışarı kaydırarak hemostatı tamamen sıkıp kilitleyin, böylece fiksantın kaybı önlenir. Hemostatı çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde tutun, mesane ise üstünde dursun. Hemostatın altını nazikçe ve dikkatlice keserek hemostat hala bağlı halde mesanesi çıkarın.

Mesanesi ve bağlı hemostatı, ısıtılmış fiksant içeren bir Falcon tüpüne yerleştirin. Mesanenin sıvının tamamen içine girdiğinden ve tüpün duvarlarına bastırılmadığından emin olun.

Elektron mikroskopisiyle mesaneyi taramalı bir şekilde görüntülemek için, temiz, çift taraflı bir jilet veya skarpelle sağaltik olarak ikiye bölünür ve hemostata teğen ikinci bir kesik keserek mesaneyi serbest bırakır. Bu sonuçta iki yarım mesane kupası oluşur. Mesanenin dışında kalan yağ pedleri varsa, onları nazikçe çıkarın.

Mesane yarısını sodyum kakodilat tamponunda üç kez durulayın. Dokuyu %1 osmiyum tetroksit ile 0,15 molar kakodilat tamponda oda sıcaklığında 1 saat boyanın. Bu adımı, karanlık bir ortam korumak için boyama kabını folyoya sararak yapın. Boyadıktan sonra mesaneyi ultra saf suyla üç kez yarıya aykırın.

Su yüzeyinde osmik yağ görülürse, kurutma aşamalarında kontaminasyonu önlemek için aspirasyon veya fitil ile alın. Dokuyu kuruttuktan sonra, mesane yarısını temiz, çift taraflı bir usorta ile ikiye bölerek toplamda dört parça elde edin.