Zebrafish embriyolarından bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilişi enfeksiyon yükünü değerlendirmek için

Mycobacterium absessus ile enfekte olmuş bir zebrafish embriyosu alın; bu, merkezi sinir sistemini hedef alan ve bakteri ile konak bağışıklık hücreleri içeren apseler oluşturan patojenik bir bakteridir.

Embriyonu buzun üzerinde inkubka ederek immobilize et, ardından kalp ve sinirsel aktiviteyi durdurmak için aşırı doz anestezi ile maruz bırakın ve bu da ölümle sonuçlanır.

Kalan anestezi almak için embriyoyu yıka.

Hücre zarlarını bozmak ve embriyonu lizlemek için bir deterjan çözeltisi ekleyin.

Lizat iğneden kesilerek dokuyu homojenleştirin ve bakterileri serbest bırakın.

Santrifüj yapın, süpernatantı atın ve pelleti bakteriyel topaklanmayı önlemek için yüzeyaktif bir çözeltiye yeniden askıya alın.

Bakteri süspansiyonu seri olarak seyreldin ve agar plakalarına yayın.

Bu ortam, diğer mikropların büyümesini engellemek için antibiyotiklerle desteklenirken, antibiyotik direnci için tasarlanmış Mycobacterium hücreleri çoğalır.

Koloni oluşumunu teşvik etmek için kuluçka, embriyonun bakteri yükünün nicelendirilmesini sağlar.

İstenilen zaman noktasında koloni oluşum birimlerini veya CFU'ları saymak için, enfeksiyon durumunda beş embriyo toplan ve her embriyoyu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Embriyoları 10 dakika boyunca buzda kuluçka geçirerek kriyoanestezi yapın. Embriyoları litrede 300 ila 500 miligram tricaine ötanizize ettikten sonra, embriyoları yeni bir tüpte iki kez steril suyla yıkayın.

Sonra, her embriyoya %2 Triton X-100 ile 1 X PBS su aldıktan sonra 26 gauge iğne kullanarak dokuyu homojenize ederek tam lizis yapın.

Süspansiyon santrifüjlendikten sonra, peleti yeniden süspansiyon yapmak için 1 X PBST kullanın. Daha sonra, homojenatların Middlebrook 7H10O^ADC üzerinde seri seyreltilmesi ve BBL MGIT PANTA ile desteklenmesi.

Kolonileri saymadan önce plakaları 30 derece Celsius'ta 4 gün kuluçkaya geçirin.