JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:46 dk • February 26th, 2026
Ekzopolisakkaritlerin in vitro fermentasyonu sırasında insan bağırsak mikrobiyotasının ürettiği süpernatantla başlayın. Süpernatant, deprotonlanmış kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar) ve diğer metabolitler içerir.
Üst yüzeyin pH'ını düşürmek için metafosforik asit ekleyin ve iyice karıştırmak için vortex ekleyin. Bu yöntem, SCFA'ları gaz kromatografisi analizi için uygun protonlu formlarına dönüştürür.
Enkazı ayırmak ve SCFA'lar ile diğer metabolitleri içeren süpernatantı toplamak için santrifüj yapın.
Süpernatantı filtreleyerek kalan kalıntıları ortadan kaldırın ve kromatografiye müdahale edilmesini önleyin.
Yüksek performanslı bir gaz kromatografi sisteminde, süpernatantı ısıtılmış girişe enjekte ederek buharlaştırılır. Sonra, buharı inert bir gazla karıştırın ve ayırmak için polar sabit faz kolonundan geçirin.
SCFA'lar sütunun durağan fazıyla etkileşime girer ve volatilitelerine göre ayrılır; kısa zincirli asitler uzun olanlardan daha erken elüasyon yapar.
Farklı SCFA'ların konsantrasyonlarını dahili standartlarla karşılaştırarak belirleyin. Bu, bağırsak benzeri koşullarda ekzopolisakkaridlerin mikrobiyal bozulmasını yansıtır
EPS'nin SCFA üretimi üzerindeki etkilerini incelemek için, 2 mililitrelik santrifüj tüplerine 1 mililitre fermente süpernatantlar eklenin ve her numuneye 0,2 mililitre 25 ağırlık/hacim oranında metafosforik asit ekleyin. Çözeltileri iyice karıştırmak için vortex. Karışımları 13.000 kat g ile 20 dakika boyunca santrifüjleyin.
Bu arada, tüplerde 120 milimolar asetik, propionik, bütürik, izobutürik, valerik ve izovalerik asitlerden oluşan çözeltiler hazırlayın. Sonra, her hazırlanmış asidin 1 mililitresini, içinde 1,2 mililitre ağırlık/hacim orantı 25 metafosforik asit içeren bir tüpte ekleyin ve bunları gaz kromatografi cihazının numune şişesine standart kokteyller olarak yükleyin.
Tüpleri santrifügeden çıkarın ve süpernatantları yeni tüplere aktarın. Üst filtreleri yeni tüplere filtrelemek için 0,22 mikron filtreli bir şırınga kullanın; gaz kromatografisi analizi için süpernantları filtreleyin.